RNA干涉ZmC4H基因影響玉米秸稈木質(zhì)素含量的研究

【摘要】：玉米(Zea Mays L.)秸稈豐要是木質(zhì)素,纖維素和半纖維素三種大分子物質(zhì)組成的。木質(zhì)素具有增強植物抗壓能力和運輸水分的作用。由于木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)復雜難以被分解,所以在生產(chǎn)中的利用效率非常低下,對紙張制造及生物燃料等生產(chǎn)造成不必要的能源消耗。本文利用基因工程手段,運用分子技術(shù)控制植物木質(zhì)素的生物合成,降低木質(zhì)素的含量,這對提高玉米秸稈的使用效率具有重要的意義。本文以玉米B73自交系為植物材料,利用RNAi技術(shù),對木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)基因進行反義抑制,構(gòu)建了C4H的干涉表達載體,通過農(nóng)桿菌介導的玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化,并對得到的后代植株進行抗除草劑篩選,同時對轉(zhuǎn)C4H基因的植株進行分子檢測和木質(zhì)素含量檢測,取得如下主要結(jié)果：1、利用PCR技術(shù)克隆得到C4H基因的部分序列,以pUCCRNAi與改造過含有Bar及CaMV35S的pCAM1301載體作為中間載體,通過基因工程成功構(gòu)建RNA干涉載體pCAM1301+C4H。2、將pCAM1301+C4H干涉表達載體通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)到玉米自交系鄭58中,獲得了抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株。3、對獲得的T1代植株進行分子PCR檢測,對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行RT-PCR分析和木質(zhì)素及纖維素進行測定,結(jié)果顯示：RNAi降低了玉米C4H基因的表達水平,轉(zhuǎn)基因植株Klason木質(zhì)素含量與野生型相比平均降低了23.50%,纖維素含量與對照相比平均降低了8.11%。4、將轉(zhuǎn)基因植株的莖稈制作切片并進行番紅染色在顯微成像系統(tǒng)下觀察,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株維管束的染色程度較對照植株的淺,證明抑制玉米C4H基因的表達水平能夠降低了植株木質(zhì)素的含量。5、對轉(zhuǎn)基因玉米植株秸稈的纖維長度和結(jié)晶度進行了測量,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株的纖維長度與對照相比平均增加了8.29%,玉米纖維結(jié)晶度值與對照相比平均降低了17.80%。綜上所述,本文成功構(gòu)建了RNA干涉表達載體pCAM1301+C4H,并將pCAM1301+C4H通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化,獲得轉(zhuǎn)基因植株；轉(zhuǎn)基因玉米秸稈的木質(zhì)素和纖維素含量均比對照降低,其中纖維素的下降幅度低于木質(zhì)素的下降幅度。 【關(guān)鍵詞】：玉米 RNAi C4H 木質(zhì)素 纖維素
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q943.2;S513
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 文獻綜述9-16
• 1.1 木質(zhì)素的概述9-11
• 1.2 木質(zhì)素的生物合成途徑上的關(guān)鍵酶類11-14
• 1.2.1 苯丙酸合成途徑涉及的酶類11-13
• 1.2.2 木質(zhì)素特異合成途徑中的酶類13
• 1.2.3 木質(zhì)素特異合成途徑下游酶類的調(diào)控13-14
• 1.3 肉桂酸4-羥基化酶的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀14-16
• 1.3.1 C4H基因的酶學性質(zhì)14
• 1.3.2 肉桂酸-4-羥化酶在木質(zhì)素生物合成中的作用14-16
• 2 引言16-17
• 3. 材料與方法17-31
• 3.1 實驗材料17
• 3.1.1 植物材料17
• 3.1.2 實驗載體與菌株17
• 3.2 實驗主要試劑17
• 3.3. 培養(yǎng)基17
• 3.4 實驗主要儀器17
• 3.5 實驗所用溶液的配制17-19
• 3.5.1 CTAB溶液的配置17-18
• 3.5.2 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的溶液配制18
• 3.5.3 培養(yǎng)基相關(guān)溶液的配制18-19
• 3.5.4 抗生素的配置19
• 3.6 米C4H基因的克隆19-21
• 3.6.1 PCR反應(yīng)及瓊脂糖電泳19-20
• 3.6.2 PCR擴增目的片段及產(chǎn)物回收20-21
• 3.7 P1301+C4H干涉表達載體的構(gòu)建21-23
• 3.7.1 C4H RNAi載體的構(gòu)建方案21
• 3.7.2 目的片段與pUCCRNAi載體酶切連接21-23
• 3.8 p1301+C4H干涉表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌23-24
• 3.8.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備23
• 3.8.2 凍融法質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌23-24
• 3.8.3 干涉表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌24
• 3.9 玉米的莖尖轉(zhuǎn)化24-25
• 3.9.1 工程菌的制備24
• 3.9.2 玉米種子的消毒與萌發(fā)24
• 3.9.3 誘導與侵染24-25
• 3.9.4 侵染苗的移栽與篩選25
• 3.10 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測25-26
• 3.10.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測25
• 3.10.2 轉(zhuǎn)基因植株的半定量RT-PCR分析25-26
• 3.11 木質(zhì)素、纖維素含量的測定及實驗方法26-29
• 3.11.1 制取草粉26-27
• 3.11.2 水分含量的測定27
• 3.11.3 木質(zhì)素含量的測定27-28
• 3.11.4 纖維素含量的測定28-29
• 3.12 番紅染色29
• 3.13 玉米秸稈纖維長度測量29-30
• 3.14 結(jié)晶度測量30-31
• 4 結(jié)果與分析31-39
• 4.1 目的基因片段的獲得31
• 4.2 載體構(gòu)建驗證31-33
• 4.2.1 pUCCRNAi+2F載體構(gòu)建驗證31-33
• 4.3 干涉載體導入農(nóng)桿菌的驗證及轉(zhuǎn)基因植株的獲得33-34
• 4.3.1 干涉載體的PCR驗證33
• 4.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得33-34
• 4.4 轉(zhuǎn)C4H基因植株的檢測34-39
• 4.4.1 轉(zhuǎn)C4H基因植株的PCR檢測34-35
• 4.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的半定量RT-PCR檢測35-36
• 4.4.3 轉(zhuǎn)基因植株的Klason木質(zhì)素與纖維素的測定36-37
• 4.4.4 轉(zhuǎn)基因植株的組織化學染色觀察37-38
• 4.4.5 轉(zhuǎn)基因植株秸稈纖維長度及結(jié)晶度測量38-39
• 5 討論39-41
• 5.1 C4H基因的下調(diào)對玉米木質(zhì)素、纖維素含量及纖維長度和結(jié)晶度的影響39-40
• 5.2 抑制C4H表達對植株的正常生長的影響40-41
• 6 結(jié)論41-42
• 參考文獻42-49
• 致謝49-50
• 個人簡介50-51
• 研究成果51

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