產(chǎn)酸芽孢桿菌的分離篩選及對玉米秸稈的微貯效果

【摘要】：青貯是秸稈飼料化利用較為成熟的技術(shù),可以最大限度地保存秸稈中的營養(yǎng)物質(zhì),為畜牧養(yǎng)殖業(yè)提供較為廉價優(yōu)質(zhì)的飼草。目前,用于秸稈青貯的微生物添加劑主要是乳酸菌類,然而乳酸菌不耐高溫,在生產(chǎn)和貯存過程中易失活,質(zhì)量不穩(wěn)定,影響了其使用效果。針對這一問題,本研究擬分離篩選可以發(fā)酵產(chǎn)酸的芽孢桿菌菌株,制備微貯菌劑,用于鮮玉米秸稈的貯存。首先從牛糞等樣品中共分離得到了芽孢菌菌株200余株,利用變色圈法從中初篩出13株可使溴甲酚紫變黃的產(chǎn)酸菌株。利用平板培養(yǎng)基打孔法對這13株菌進(jìn)行了復(fù)篩,最終獲得1株產(chǎn)酸量較高的芽孢桿菌R42-16菌株。該菌株可以發(fā)酵糖產(chǎn)生多種有機(jī)酸,其中乙酸、乳酸的產(chǎn)量較高,液體發(fā)酵條件下分別為220.70μg/m L、174.25μg/m L。根據(jù)菌落形態(tài)、菌體特征、生理生化試驗、以及16S r DNA序列分析,菌株R42-16被鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。對R42-16菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),該菌株對酸、膽酸鹽具有較強的耐受性,耐受p H的范圍為1.0~7.0,耐受膽酸鹽的范圍為0.1%~0.3%;該菌株對蔗糖、果糖的利用率均較高;同時,菌株R42-16對致病大腸桿菌O157:H7具有較強的拮抗活性。通過單因素試驗和正交試驗,對菌株R42-16的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化培養(yǎng)基為:玉米粉1.0%、酵母浸粉2.0%、Mn SO4·H2O 0.01%、Ca Cl2·H2O 0.01%;適宜的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基p H6.0、裝液量為50m L/250m L三角瓶、接種量為4.0m L/瓶、發(fā)酵時間為48h。在此培養(yǎng)條件下,發(fā)酵液中菌株R42-16的活菌數(shù)為3.19×109CFU·m L-1,芽孢形成率為93.76%。對菌株R42-16對玉米秸稈的發(fā)酵效果進(jìn)行了評價。設(shè)定菌劑施用量分別為8.0×108 CFU/kg(試驗組Ⅰ)、1.0×109 CFU/kg(試驗組Ⅱ)和1.2×109 CFU/kg(試驗組Ⅲ),發(fā)酵30d,對各試驗組秸稈的營養(yǎng)指標(biāo)對比如下:與青貯對照組相比,試驗組Ⅰ中的乳酸、乙酸含量差異不顯著(p0.05),試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ中兩者的含量均顯著增加(p0.05),試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ的乳酸含量分別提高24.38%、25.0%,乙酸含量分別提高292.87%、338.52%。但試驗組Ⅱ和試驗組Ⅲ之間差異不顯著(p0.05)。試驗組Ⅰ中的丁酸含量、氨態(tài)氮/總氮與對照組相比差異不顯著(p0.05),而試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ與對照組相比,顯著降低(p0.05),試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ的丁酸含量分別降低了47.34%、53.36%;氨態(tài)氮/總氮分別降低了36.89%、42.33%。但試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ之間差異不顯著(p0.05)。試驗組Ⅰ的粗蛋白含量與對照組相比,差異不顯著(p0.05),試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ與對照組相比,含量顯著增加(p0.05),試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ的粗蛋白含量分別為8.43%、9.11%,與對照組相比分別增加了50.26%、62.39%。但是,各試驗組的干物質(zhì)、粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素含量等指標(biāo)差異不顯著(P0.05)。針對青貯秸稈暴露在空氣中(開窖后)容易產(chǎn)生“二次發(fā)酵”的問題,本文從物料溫度、p H、氣味感官等方面對發(fā)酵秸稈進(jìn)行了有氧穩(wěn)定性的測定。結(jié)果表明,在室溫為18℃的條件下,三個試驗組和青貯對照組在第1-8天時料溫均接近于室溫。對照組在第9天時料溫開始上升,第10天時料溫高于室溫1.57℃,此時青貯秸稈開始呈現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài),第14天時料溫高于室溫3.09℃,呈現(xiàn)“二次發(fā)酵”癥狀。而此時試驗組的料溫僅高于室溫1.1℃左右。測定秸稈的p H變化發(fā)現(xiàn),在第1-8天時青貯對照組與試驗組的p H相差均不大,對照組p H在第10-12天時上升較快,在第12天時已經(jīng)達(dá)到了5.59。一般認(rèn)為秸稈的p H達(dá)到5.0時即發(fā)生了“二次發(fā)酵”,當(dāng)p H為5.5時秸稈不能再飼喂。但試驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在第15天時的p H分別為4.23、4.03、4.03。表明在秸稈中添加菌株R42-16能夠提高發(fā)酵玉米秸稈的穩(wěn)定性。綜上所述,菌株R42-16可以作為微生物添加劑應(yīng)用于玉米秸稈的微貯。 【關(guān)鍵詞】：玉米秸稈 青貯 微貯 芽孢桿菌 發(fā)酵 有機(jī)酸 有氧穩(wěn)定性
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S816.53
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-17
• 1.1 青貯秸稈的微生物發(fā)酵機(jī)理及發(fā)酵過程12-13
• 1.1.1 青貯秸稈的發(fā)酵機(jī)理12
• 1.1.2 青貯秸稈的發(fā)酵過程12-13
• 1.2 影響秸稈發(fā)酵品質(zhì)的因素13-14
• 1.2.1 水溶性碳水化合物13
• 1.2.2 水分13-14
• 1.2.3 緩沖力14
• 1.2.4 密封性14
• 1.3 秸稈青貯添加劑的研究進(jìn)展14-15
• 1.3.1 添加青貯添加劑的目的14
• 1.3.2 青貯添加劑的種類14
• 1.3.3 細(xì)菌添加劑菌株的選擇14-15
• 1.3.4 乳酸菌添加劑的效果及不足15
• 1.4 芽孢桿菌添加劑15-16
• 1.5 本文的研究內(nèi)容及目的意義16-17
• 第2章 產(chǎn)酸芽孢桿菌的分離、篩選及鑒定17-25
• 2.1 試驗材料17-18
• 2.1.1 樣品17
• 2.1.2 培養(yǎng)基17
• 2.1.3 試劑17
• 2.1.4 試驗儀器17-18
• 2.2 試驗方法18-19
• 2.2.1 溴甲酚紫平板的制作18
• 2.2.2 菌株初篩18
• 2.2.3 菌株復(fù)篩18
• 2.2.4 菌株產(chǎn)物鑒定18
• 2.2.5 菌株的鑒定18-19
• 2.3 試驗結(jié)果19-23
• 2.3.1 初篩試驗結(jié)果19-20
• 2.3.2 復(fù)篩試驗結(jié)果20
• 2.3.3 菌株鑒定20-22
• 2.3.4 產(chǎn)物鑒定結(jié)果22-23
• 2.4 討論23-25
• 第3章 解淀粉芽孢桿菌R42-16 菌株的生物學(xué)特性25-31
• 3.1 試驗材料25
• 3.1.1 供試菌株25
• 3.1.2 培養(yǎng)基25
• 3.1.3 試驗儀器25
• 3.2 試驗方法25-27
• 3.2.1 菌株R42-16 的生長曲線測定25
• 3.2.2 菌株R42-16 對酸的耐受性25-26
• 3.2.3 菌株R42-16 對膽酸鹽的耐受性26
• 3.2.4 菌株R42-16 對蔗糖的利用26
• 3.2.5 菌株R42-16 對果糖的利用26
• 3.2.6 菌株R42-16 對致病大腸桿菌的拮抗活性26
• 3.2.7 菌株R42-16 產(chǎn)纖維素酶的能力26
• 3.2.8 菌株R42-16 產(chǎn)蛋白酶的能力26-27
• 3.3 試驗結(jié)果27-30
• 3.3.1 菌株R42-16 的生長曲線27
• 3.3.2 菌株R42-16 對酸的耐受性27-28
• 3.3.3 菌株R42-16 對膽酸鹽的耐受性28
• 3.3.4 菌株R42-16 對蔗糖的利用28
• 3.3.5 菌株R42-16 對果糖的利用28-29
• 3.3.6 菌株R42-16 對大腸桿菌的拮抗活性29
• 3.3.7 菌株R42-16 產(chǎn)纖維素酶的能力29-30
• 3.3.8 菌株R42-16 產(chǎn)蛋白酶的能力30
• 3.4 討論30-31
• 第4章 解淀粉芽孢桿菌R42-16 菌株產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化31-39
• 4.1 試驗材料31
• 4.1.1 供試菌株31
• 4.1.2 培養(yǎng)基31
• 4.2 試驗方法31-32
• 4.2.1 菌株種子培養(yǎng)31
• 4.2.2 菌株發(fā)酵培養(yǎng)31
• 4.2.3 單因素試驗31-32
• 4.2.4 培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化32
• 4.2.5 測定方法32
• 4.3 試驗結(jié)果32-38
• 4.3.1 碳源對菌株R42-16 菌體生長及芽孢形成的影響32-33
• 4.3.2 氮源對菌株R42-16 菌體生長及芽孢形成的影響33-34
• 4.3.3 無機(jī)鹽對菌株R42-16 菌體生長及芽孢形成的影響34-35
• 4.3.4 培養(yǎng)基組成正交優(yōu)化試驗結(jié)果35-36
• 4.3.5 培養(yǎng)條件正交優(yōu)化的試驗結(jié)果36-38
• 4.4 討論38-39
• 第5章 解淀粉芽孢桿菌R42-16 對秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響39-44
• 5.1 試驗材料39
• 5.1.1 玉米秸稈39
• 5.1.2 菌液39
• 5.1.3 試驗儀器39
• 5.2 試驗方法39-40
• 5.2.1 玉米秸稈發(fā)酵39-40
• 5.2.2 發(fā)酵玉米秸稈的水分、pH、有機(jī)酸、氨態(tài)氮的測定40
• 5.2.3 發(fā)酵玉米秸稈的營養(yǎng)成分測定40
• 5.3 試驗結(jié)果40-42
• 5.3.1 發(fā)酵玉米秸稈水分、pH、有機(jī)酸、氨態(tài)氮的測定40-41
• 5.3.2 發(fā)酵玉米秸稈的營養(yǎng)成分分析41-42
• 5.4 討論42-44
• 第6章 發(fā)酵玉米秸稈有氧穩(wěn)定性的研究44-47
• 6.1 試驗材料44
• 6.1.1 發(fā)酵玉米秸稈44
• 6.1.2 試驗儀器44
• 6.2 試驗方法44
• 6.3 試驗結(jié)果44-45
• 6.3.1 發(fā)酵玉米秸稈感官評定44
• 6.3.2 發(fā)酵玉米秸稈的料溫變化44-45
• 6.3.3 發(fā)酵玉米秸稈的有氧穩(wěn)定性pH值變化45
• 6.4 討論45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 在讀期間發(fā)表論文52-53
• 作者簡歷53-54
• 致謝54-55

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