黃孢原毛平革菌發(fā)酵秸稈產(chǎn)乙醇工藝的優(yōu)化及菌株改良

【摘要】：經(jīng)濟的飛速發(fā)展使得能源問題日益突出,石油價格不斷上漲,生物質(zhì)能源的開發(fā)迫在眉睫。其中乙醇以其清潔、可再生的優(yōu)點受到重視。我國燃料乙醇產(chǎn)業(yè)起步較晚但發(fā)展迅速,目前國家已將燃料乙醇的發(fā)展方向調(diào)整為以秸稈等非糧作物為主體原料。黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一株典型的白腐真菌,被廣泛應(yīng)用于纖維素和木質(zhì)素材料的降解,可以實現(xiàn)對玉米秸稈中纖維素的降解。并且乙醇是P.chrysosporium降解纖維素過程中重要的次級代謝產(chǎn)物。本文由此立題,首次嘗試利用P.chrysosporium降解秸稈直接進行乙醇發(fā)酵。本研究首先對P.chrysosporium在液體和固態(tài)發(fā)酵條件下利用秸稈產(chǎn)乙醇的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。然后利用紫外照射的誘變方法對P.chrysosporium進行誘變育種,經(jīng)發(fā)酵驗證乙醇產(chǎn)量后對乙醇產(chǎn)量和穩(wěn)定性最好的突變菌株Y2-5進行乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)基因的序列分析。主要研究成果包括如下幾方面:(1)P.chrysosporium發(fā)酵玉米秸稈在液態(tài)條件下的最佳培養(yǎng)基配方為:玉米秸稈粉20 g/L,葡萄糖10 g/L,酒石酸銨2.4 g/L,吐溫80 0.4%。(2)最佳發(fā)酵條件為:裝液量20%,初始p H 4.5,溫度37℃,轉(zhuǎn)速180 rpm,孢子懸液接種量2%(孢子數(shù)≥107個/m L),發(fā)酵時長11 d。優(yōu)化之后乙醇產(chǎn)量最高達到3.692 g/L,較優(yōu)化前提高了163%。(3)固態(tài)發(fā)酵需要預(yù)先經(jīng)1%的H2SO4溶液進行酸處理。酸處理后的秸稈中木質(zhì)素和半纖維素結(jié)構(gòu)含量明顯減少,相應(yīng)纖維素含量增加了35%。(4)最佳固態(tài)發(fā)酵條件為:含水量60%,外源營養(yǎng)物為優(yōu)化后液體培養(yǎng)基,玉米和麩皮混合比例為6:4,33℃靜置發(fā)酵11 d。乙醇產(chǎn)量達到1.562 g/100g DS。(5)P.chrysosporium紫外誘變最佳照射時長為180 s。并得到三株具有較高乙醇脫氫酶(ADH)活性的誘變菌株Y1、Y2-1和Y2-5。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下乙醇產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高約10%。(6)突變菌株Y2-5具有較好的遺傳穩(wěn)定性,ADH活力在第8 d達到峰值210 U/L,高于出發(fā)菌株約12%。(7)突變株Y2-5與已知P.chrysosporium乙醇脫氫酶蛋白的預(yù)測三維結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)突變后新增了一個NAD酶合成有效位點。 【關(guān)鍵詞】：秸稈 纖維素乙醇 黃孢原毛平革菌 誘變
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TQ223.122
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 乙醇的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝12
• 1.2 生物乙醇的發(fā)展現(xiàn)狀12-13
• 1.3 再生纖維素原料簡介13-16
• 1.3.1 纖維素（Cellulose）14-15
• 1.3.2 木質(zhì)素（Lignin）15
• 1.3.3 半纖維素（Hemi-cellulose）15
• 1.3.4 作物秸稈的利用15-16
• 1.4 發(fā)酵秸稈產(chǎn)乙醇技術(shù)16-17
• 1.5 黃孢原毛平革菌簡介17
• 1.6 黃孢原毛平革菌的功能和應(yīng)用17-18
• 1.7 乙醇脫氫酶的作用18-19
• 1.8 微生物誘變育種技術(shù)19-20
• 1.8.1 誘變育種技術(shù)的研究進展19
• 1.8.2 誘變育種的特點19-20
• 1.9 課題研究目的和意義20-22
• 第二章 P. chrysosporium液體發(fā)酵秸稈產(chǎn)乙醇和發(fā)酵條件的優(yōu)化22-43
• 引言22
• 2.1 材料與方法22-29
• 2.1.1 實驗材料22-23
• 2.1.2 實驗方法23-29
• 2.2 結(jié)果與分析29-41
• 2.2.1 P. chrysosporium發(fā)酵產(chǎn)酶曲線29-30
• 2.2.2 裝液量對乙醇產(chǎn)量的影響30-31
• 2.2.3 發(fā)酵時長對乙醇產(chǎn)量的影響31-32
• 2.2.4 氮源種類對乙醇產(chǎn)量的影響32-33
• 2.2.5 氮源濃度對乙醇產(chǎn)量的影響33-34
• 2.2.6 碳源種類對乙醇產(chǎn)量的影響34-35
• 2.2.7 葡萄糖濃度對乙醇產(chǎn)量的影響35-36
• 2.2.8 吐溫80對乙醇產(chǎn)量的影響36-37
• 2.2.9 培養(yǎng)溫度對乙醇產(chǎn)量的影響37-38
• 2.2.10搖床轉(zhuǎn)速對乙醇產(chǎn)量的影響38-39
• 2.2.11 初始p H對乙醇產(chǎn)量的影響39-40
• 2.2.12 還原糖含量的測定40-41
• 2.3 結(jié)論與展望41-43
• 2.3.1 本章結(jié)論41
• 2.3.2 展望41-43
• 第三章 P. chrysosporium固體發(fā)酵秸稈產(chǎn)乙醇工藝優(yōu)化43-54
• 引言43
• 3.1 材料與方法43-44
• 3.1.1 菌株43
• 3.1.2 培養(yǎng)基43
• 3.1.3 基質(zhì)43-44
• 3.1.4 主要試劑和儀器44
• 3.2 實驗方法44-48
• 3.2.1 測定方法44
• 3.2.2 乙醇的測定方法44
• 3.2.3 纖維素酶酶活的測定方法44
• 3.2.4 木質(zhì)素過氧化物酶（Li P）酶活測定44
• 3.2.5 菌株的活化與孢子懸液的制備44-45
• 3.2.6 預(yù)處理方式的選擇45-47
• 3.2.7 物料含水量對乙醇產(chǎn)量的影響47
• 3.2.8 添加不同外源營養(yǎng)物對乙醇產(chǎn)量的影響47
• 3.2.9 發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量的影響47
• 3.2.10混合基質(zhì)配比對乙醇產(chǎn)量的影響47-48
• 3.3 結(jié)果與討論48-53
• 3.3.1 預(yù)處理方式的選擇48-49
• 3.3.2 物料濕度對乙醇產(chǎn)量的影響49-50
• 3.3.3 添加不同外源營養(yǎng)物對乙醇產(chǎn)量的影響50-51
• 3.3.4 發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量的影響51-52
• 3.3.5 混合基質(zhì)配比對乙醇產(chǎn)量的影響52-53
• 3.4 結(jié)論與展望53-54
• 3.4.1 本章結(jié)論53
• 3.4.2 展望53-54
• 第四章 P. chrysosporium菌株的誘變和ADH序列分析54-73
• 引言54
• 4.1 材料與方法54-57
• 4.1.1 材料54-55
• 4.1.2 實驗方法55-57
• 4.2 結(jié)果與討論57-71
• 4.2.1 紫外誘變致死率曲線57-58
• 4.2.2 誘變后培養(yǎng)與優(yōu)勢菌的篩選58-59
• 4.2.3 誘變菌株發(fā)酵玉米秸稈驗證乙醇產(chǎn)量59-61
• 4.2.4 誘變菌株的穩(wěn)定性61-62
• 4.2.5 P. chrysosporium突變株ADH基因的克隆與序列分析62-71
• 4.3 結(jié)論與展望71-73
• 4.3.1 本章結(jié)論71
• 4.3.2 展望71-73
• 參考文獻73-83
• 致謝83-85
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄85-86

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