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利用秸稈水解液的微生物暗發(fā)酵產(chǎn)氫特性及機(jī)制研究

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利用秸稈水解液的微生物暗發(fā)酵產(chǎn)氫特性及機(jī)制研究【摘要】:秸稈類木質(zhì)纖維素以其數(shù)量大、價(jià)格低廉、可再生、獲取容易等諸多優(yōu)點(diǎn)成為暗發(fā)酵生物制氫潛在的適宜底物。利用秸稈類物質(zhì)進(jìn)行生物制氫

【摘要】:秸稈類木質(zhì)纖維素以其數(shù)量大、價(jià)格低廉、可再生、獲取容易等諸多優(yōu)點(diǎn)成為暗發(fā)酵生物制氫潛在的適宜底物。利用秸稈類物質(zhì)進(jìn)行生物制氫可以大大降低氫氣的生產(chǎn)成本,使生物制氫在經(jīng)濟(jì)上更具有可行性,同時(shí)避免了秸稈類物質(zhì)通常的焚燒處理導(dǎo)致的嚴(yán)重環(huán)境污染。然而,秸稈類物質(zhì)具有高結(jié)晶度、高異質(zhì)性的復(fù)雜結(jié)構(gòu),致使微生物對(duì)其的直接降解效率較低。因此,利用富含戊糖、己糖的秸稈水解液進(jìn)行微生物發(fā)酵產(chǎn)氫成為生物制氫產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要發(fā)展方向。目前,在混合微生物進(jìn)行秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程中,存在著底物降解不充分,產(chǎn)氫效率較低等瓶頸問(wèn)題,嚴(yán)重阻礙了秸稈水解液產(chǎn)氫的生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用。另一方面,對(duì)秸稈水解液利用過(guò)程中的微生物產(chǎn)氫分子機(jī)制亦不清楚,難以從理論層面指導(dǎo)實(shí)際產(chǎn)氫工藝的運(yùn)行過(guò)程。 基于此,本研究考察了種泥預(yù)處理和發(fā)酵溫度對(duì)不同類型混合微生物利用秸稈水解液產(chǎn)氫過(guò)程的影響。為提高系統(tǒng)的底物降解率與產(chǎn)氫能力,采用對(duì)秸稈水解液具有高效降解、產(chǎn)氫能力的菌株Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16對(duì)混合微生物利用秸稈水解液產(chǎn)氫過(guò)程進(jìn)行了生物強(qiáng)化。通過(guò)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和木質(zhì)纖維素降解基因分析闡述了T.thermosaccharolyticum類型微生物在秸稈類物質(zhì)利用過(guò)程中的分子機(jī)制。對(duì)菌株W16的[FeFe]-氫化酶基因簇進(jìn)行了基因克隆、特征分析與轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析,解析了T. thermosaccharolyticum類型微生物的產(chǎn)氫機(jī)制。 結(jié)果表明,熱、酸、堿、超聲和紫外五種預(yù)處理方法中,熱預(yù)處理對(duì)活性污泥、河流底泥和顆粒污泥中混合微生物的產(chǎn)氫過(guò)程具有較好提升效果,熱預(yù)處理下的活性污泥接種達(dá)到了最大的氫氣產(chǎn)量5.03mmol/g-sugar utilizedo在不同發(fā)酵溫度(30℃、37℃、55℃、70℃)中,55℃時(shí)三種類型種泥均達(dá)到最高氫氣產(chǎn)量,顆粒污泥接種時(shí)數(shù)值最大(7.74mmol/g-sugar utilized),而70℃時(shí)混合微生物對(duì)秸稈水解液的產(chǎn)氫效能顯著低于55℃。預(yù)處理過(guò)程和高溫條件顯著改變了微生物群落結(jié)構(gòu),使之由Enterobacter spp.、Escherichia spp.、 Klebsiella spp.等兼性微生物的普遍存在,轉(zhuǎn)變?yōu)镃lostridium spp.、 Bacillus spp. Thermoanaerobacterium spp等高效厭氧產(chǎn)氫微生物的大量富集。 菌株W16的生物強(qiáng)化作用可以顯著提升腐爛秸稈和厭氧污泥接種時(shí)混合微生物利用秸稈水解液過(guò)程的氫氣產(chǎn)量,同時(shí)一定程度提高了底物降解率,生物強(qiáng)化下的腐爛秸稈接種達(dá)到最高的氫氣產(chǎn)量9.90mmol-H2/g-sugar utilized。AFLP分析顯示T. thermosaccharolyticum類型微生物具有較高的基因組DNA保守性,差異條帶中的2-polyprenylphenol6-hydroxylase基因可能為T.thermosaccharolyticum類型微生物較強(qiáng)木質(zhì)纖維素降解能力的關(guān)鍵因素。此外,在T. thermosaccharolyticum中的木質(zhì)纖維素降解基因中,Cellulose1,4-beta-cellobiosidase基因中-10區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)處的單堿基差異可能與T. thermosaccharolyticum類型微生物對(duì)纖維素的利用效果密切相關(guān)。 克隆得到了菌株W16[FeFe]-氫化酶hyd和hfs基因簇的完整DNA序列,分別包含hyaⅡ (1308bp)、 hydC (480bp)、 hydD (363bp)、 hydB (1788bp)和hydA (1752bp),以及hfsA (243bp)、hfsB (1716bp)和hfsC (1512bp),其中hyaⅡ、hydB、 hydA、hfsB和hfsC為較重要的氫化酶基因。分析了hyd和hfs基因簇中各基因的DNA序列特征、對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能區(qū)與保守區(qū)??疾觳煌瑲庀鄺l件(起始N2、H2或CO2灌注)對(duì)氫化酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。對(duì)hyd基因簇,hydA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程在高H2或高CO2分壓下被嚴(yán)重抑制;hyaB只對(duì)高H2分壓較為敏感;hyaⅡ在高N2、高H2或高CO2分壓下都表達(dá)量較低。對(duì)hfs基因簇,hfsB在高CO2分壓下表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄活性,在高H2分壓下轉(zhuǎn)錄表達(dá)較低;hfsC基因在高CO2分壓下的轉(zhuǎn)錄水平最低。 【關(guān)鍵詞】:生物制氫 秸稈水解液 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 生物強(qiáng)化 [FeFe]-氫化酶
【學(xué)位授予單位】:哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2012
【分類號(hào)】:X712
【目錄】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-8
  • 目錄8-16
  • 第1章 緒論16-34
  • 1.1 課題背景16-17
  • 1.1.1 課題來(lái)源16
  • 1.1.2 研究的目的及意義16-17
  • 1.2 氫能與生物制氫技術(shù)17-19
  • 1.2.1 氫能的優(yōu)越性及發(fā)展過(guò)程17-18
  • 1.2.2 氫能的制取方法18-19
  • 1.3 發(fā)酵法生物制氫技術(shù)19-25
  • 1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)氫機(jī)理與類型19-21
  • 1.3.2 發(fā)酵產(chǎn)氫微生物21-22
  • 1.3.3 發(fā)酵細(xì)菌氫化酶及其產(chǎn)氫調(diào)控22-24
  • 1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程影響因素24-25
  • 1.4 秸稈類木質(zhì)纖維素產(chǎn)氫25-29
  • 1.4.1 秸稈類木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)組成與預(yù)處理26-27
  • 1.4.2 秸稈類木質(zhì)纖維素產(chǎn)氫研究現(xiàn)狀27-29
  • 1.5 生物制氫分子生態(tài)學(xué)研究現(xiàn)狀29-31
  • 1.5.1 變性梯度凝膠電泳技術(shù)30-31
  • 1.5.2 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)31
  • 1.5.3 熱不對(duì)稱交錯(cuò) P C R 技術(shù)31
  • 1.6 本課題主要研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線31-34
  • 第2章 試驗(yàn)材料與方法34-50
  • 2.1 試驗(yàn)材料34
  • 2.1.1 試驗(yàn)菌種和產(chǎn)氫種泥34
  • 2.1.2 試驗(yàn)底物34
  • 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備34-39
  • 2.2.1 主要試劑34-36
  • 2.2.2 主要引物36-37
  • 2.2.3 主要試劑盒37
  • 2.2.4 主要儀器設(shè)備37-39
  • 2.3 試驗(yàn)方法39-50
  • 2.3.1 種泥與秸稈的預(yù)處理39
  • 2.3.2 培養(yǎng)基配制及間歇培養(yǎng)試驗(yàn)39-41
  • 2.3.3 化學(xué)分析方法41-42
  • 2.3.4 產(chǎn)氫動(dòng)力學(xué)分析42-43
  • 2.3.5 核酸提取純化與克隆43-45
  • 2.3.6 微生物群落結(jié)構(gòu)分析45
  • 2.3.7 菌株 W16 [FeFe] - 氫化酶基因簇的克隆45-47
  • 2.3.8 菌株 W16 [FeFe] - 氫化酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)47-48
  • 2.3.9 AFLP (擴(kuò)增性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)試驗(yàn)48-49
  • 2.3.10 生物信息學(xué)分析49-50
  • 第3章 混合微生物利用秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫影響因素50-86
  • 3.1 引言50-51
  • 3.2 種泥預(yù)處理對(duì)秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫的影響51-68
  • 3.2.1 生物氣累積與氫氣產(chǎn)量51-55
  • 3.2.2 產(chǎn)氫過(guò)程動(dòng)力學(xué)分析55-57
  • 3.2.3 液相末端產(chǎn)物組成57-59
  • 3.2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)特征59-62
  • 3.2.5 微生物種群鑒定與功能分析62-67
  • 3.2.6 末端 pH 、生物量、底物利用、氫氣產(chǎn)量與平均產(chǎn)氫速率67-68
  • 3.3 發(fā)酵溫度對(duì)秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫的影響68-79
  • 3.3.1 生物氣累積與氫氣產(chǎn)量68-70
  • 3.3.2 產(chǎn)氫過(guò)程動(dòng)力學(xué)分析70-71
  • 3.3.3 液相末端產(chǎn)物組成71-73
  • 3.3.4 微生物群落結(jié)構(gòu)特征73-74
  • 3.3.5 微生物種群鑒定與分析74-78
  • 3.3.6 生物量、末端 pH 、底物利用、氫氣產(chǎn)量與平均產(chǎn)氫速率78-79
  • 3.4 70 °C 下其他類型種泥利用秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫79-84
  • 3.4.1 生物氣累積與氫氣產(chǎn)量80-81
  • 3.4.2 產(chǎn)氫過(guò)程動(dòng)力學(xué)分析81
  • 3.4.3 微生物群落結(jié)構(gòu)與種群鑒定81-84
  • 3.4.4 生物量、末端 p H 、底物利用、氫氣產(chǎn)量與平均產(chǎn)氫速率84
  • 3.5 本章小結(jié)84-86
  • 第4章 T.t hermosaccharolyticum W16 對(duì)混合微生物利用秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)氫的生物強(qiáng)化與機(jī)制86-110
  • 4.1 引言86
  • 4.2 菌株 W 16 對(duì)混合微生物利用秸稈水解液產(chǎn)氫的生物強(qiáng)化86-94
  • 4.2.1 生物氣累積量與氫氣產(chǎn)量87-88
  • 4.2.2 液相末端產(chǎn)物組成88-89
  • 4.2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)特征89-93
  • 4.2.4 末端 p H 、底物利用,氫氣產(chǎn)量和平均產(chǎn)氫速率93-94
  • 4.3 AFLP 技術(shù)解析 T.thermosaccharolyticum 類型微生物對(duì)秸稈類物質(zhì)的降解機(jī)制94-103
  • 4.3.1 菌株基因組 DNA 的提取94-95
  • 4.3.2 基因組 DNA 的 EcoRI/MseI雙酶切95-96
  • 4.3.3 EcoRI / MseI 雙酶切產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增與選擇性擴(kuò)增96-99
  • 4.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的 AFLP 指紋圖譜多態(tài)性分析99-102
  • 4.3.5 AF LP 指紋圖譜條帶測(cè)序分析102-103
  • 4.4 T.thermosaccharolyticum木質(zhì)纖維素降解基因序列分析103-108
  • 4.4.1 木質(zhì)纖維素降解基因的 PCR 擴(kuò)增103-105
  • 4.4.2 纖維素降解基因的序列比較分析105-106
  • 4.4.3 半纖維素降解基因簇的序列比較分析106-108
  • 4.5 本章小結(jié)108-110
  • 第5章 T.thermosaccharolyticum W16 [FeFe]- 氫化酶基因簇克隆與轉(zhuǎn)錄表達(dá)110-144
  • 5.1 引言110
  • 5.2 [ FeFe]-氫化酶 hyd 基因簇的克隆、鑒定與分析110-126
  • 5.2.1 基因保守區(qū)克隆111-113
  • 5.2.2 基因全長(zhǎng)克隆113-114
  • 5.2.3 核酸序列分析114-118
  • 5.2.4 編碼蛋白序列分析與特性預(yù)測(cè)118-121
  • 5.2.5 基因功能區(qū)與編碼蛋白保守區(qū)分析121-126
  • 5.3 高效產(chǎn)氫菌 W16 [ FeFe]-氫化酶 hfs基因簇的克隆與分析126-135
  • 5.3.1 基因保守區(qū)克隆126-127
  • 5.3.2 基因全長(zhǎng)克隆127
  • 5.3.3 核酸序列分析127-129
  • 5.3.4 編碼蛋白序列分析與特征預(yù)測(cè)129-131
  • 5.3.5 基因功能區(qū)與編碼蛋白保守區(qū)分析131-135
  • 5.4 不同氣相條件下菌株 W16 發(fā)酵產(chǎn)氫與關(guān)鍵氫化酶基因表達(dá)135-142
  • 5.4.1 氣相組成136-137
  • 5.4.2 生物氣累積與氫氣產(chǎn)量137-138
  • 5.4.3 氫氣產(chǎn)生速率與生物量增長(zhǎng)趨勢(shì)138
  • 5.4.4 液相末端產(chǎn)物組成138-139
  • 5.4.5 重要?dú)浠富蜣D(zhuǎn)錄表達(dá)139-141
  • 5.4.6 pH 、底物利用、氫氣產(chǎn)量和最大產(chǎn)氫速率141-142
  • 5.5 本章小結(jié)142-144
  • 結(jié)論144-146
  • 參考文獻(xiàn)146-161
  • 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其它成果161-164
  • 致謝164-165
  • 個(gè)人簡(jiǎn)歷165


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利用酒糟固態(tài)發(fā)酵多維多酶高賴氨酸飼料的研究    王建華,梁金鐘,王宇,張智,劉復(fù)軍,白長(zhǎng)倫,呂偉民,徐速,陳成

生物制氫技術(shù)的研究與發(fā)展    李建政,任南琪

生物技術(shù)在處理農(nóng)作物秸稈飼料中的應(yīng)用    曹玉鳳,李英,劉榮昌,劉國(guó)艷,李建國(guó)

L-半胱氨酸對(duì)細(xì)菌產(chǎn)氫過(guò)程的促進(jìn)作用    謝天卉

產(chǎn)氫—產(chǎn)乙醇細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能研究    邢德峰

光發(fā)酵細(xì)菌的選育及其與暗發(fā)酵細(xì)菌耦合產(chǎn)氫研究    劉冰峰

拜氏梭菌RZF-1108產(chǎn)氫性能及其產(chǎn)氫代謝特性研究    付娜

厭氧發(fā)酵法生物制氫菌種的選育及發(fā)酵工藝的初步研究    陳宇

自凝集產(chǎn)氫細(xì)菌代謝特性及擴(kuò)大培養(yǎng)研究    謝天卉

L-半胱氨酸對(duì)產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3產(chǎn)氫和生長(zhǎng)的影響    段志潔

近平滑假絲酵母木糖還原酶基因的克隆及表達(dá)研究    曲有鵬

利用有機(jī)廢棄物的發(fā)酵產(chǎn)氫    肖本益,劉俊新

發(fā)酵產(chǎn)氫的影響因素Ⅰ接種物和基質(zhì)    沈李東;俞津津;姬玉欣;金仁村;

不同底物種類對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響    鄭先君,陳志軍,魏麗芳,??℃?謝冰

厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的關(guān)鍵生態(tài)因子強(qiáng)化研究進(jìn)展    蒲貴兵;孫可偉;

不同陰離子在生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫中的作用研究    馬歡;劉偉偉;劉士清;

餐廚垃圾資源化技術(shù)研究探討    顧廣發(fā);李勇;任維琰;邱德斌;

不同來(lái)源污泥接種餐廚垃圾厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫效果研究    焦剛珍;李明;趙由才;

厭氧產(chǎn)氫細(xì)菌發(fā)酵類型和生態(tài)學(xué)的研究    李白昆,呂炳南,任南琪

利用廢水和固體廢棄物中有機(jī)質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫研究進(jìn)展    蔡木林,劉俊新

生物制氫技術(shù)的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景    王繼華,趙愛(ài)萍

微生物發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程的化學(xué)計(jì)量學(xué)及熱力學(xué)分析    王玉波;李煒煒;樊耀亭;侯紅衛(wèi);

不同陰離子在生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫中的作用研究    馬歡;劉偉偉;王秀菊;劉士清;李建昌;張無(wú)敵;

不同陰離子在生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫中的作用研究    馬歡;劉偉偉;王秀菊;劉士清;李建昌;張無(wú)敵;

超聲波強(qiáng)化微生物對(duì)偶氮染料AO7的降解研究    沈政贏;袁東星;

B-298菌株代謝產(chǎn)物對(duì)番茄致病菌的抑制作用    漆巨容;劉正富;武崢;曾順德;張迎君;

微生物結(jié)構(gòu)與功能基因組研究進(jìn)展    聞?dòng)衩?

微生物對(duì)化妝品殺菌防腐劑的耐受性和抗藥性及其治理措施研究    歐陽(yáng)友生;黃小茉;王春華;謝小保;施慶珊;陳儀本;

殺蟲(chóng)微生物農(nóng)藥生物技術(shù)研究進(jìn)展    黃大昉;

生物陶粒反應(yīng)器處理效果及微生物生長(zhǎng)規(guī)律研究    邱珊;馬放;高國(guó)偉;沃源;

土壤中硝化、反硝化微生物的研究進(jìn)展    殷士學(xué);陳麗敏;

國(guó)際空間站發(fā)現(xiàn)不速之客    記者 董映璧

巨病毒可能是“第四類微生物”    楊駿

向微生態(tài)領(lǐng)域進(jìn)軍    呂麗華

淺談百年老窖的形成及養(yǎng)護(hù)    山東蘭陵美酒股份有限公司 金剛 徐希望

拖把 藏污納垢的老巢    錢龍

手上微生物因人而異,可當(dāng)破案線索    

山東澳利 微生物催生綠色GDP    本報(bào)記者  管斌 通訊員  孫鑫

“奮進(jìn)”號(hào)承擔(dān)細(xì)菌培養(yǎng)任務(wù)    劉霞

城陽(yáng)農(nóng)家宴污水處理將用上“微生物”    本報(bào)記者 霍峰本報(bào)通訊員 劉桂妮

勝利微生物單井防蠟技術(shù)累計(jì)增油9000噸    記者 王金法 通訊員 吳秀芳

利用秸稈水解液的微生物暗發(fā)酵產(chǎn)氫特性及機(jī)制研究    張坤

高效油脂降解菌的篩選及其對(duì)油脂廢水的強(qiáng)化處理研究    秦華明

生物質(zhì)高效水解及發(fā)酵產(chǎn)氫的機(jī)理研究    戚峰

污水廠剩余污泥水解及其厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)研究    郭亮

Klebsiella pneumoniae ECU-15菌株暗發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程分析及其利用木質(zhì)纖維素水解液的實(shí)驗(yàn)研究    牛坤

生物菌劑的構(gòu)建及其在污水處理中的生物強(qiáng)化效能    郭靜波

鞘氨醇單胞菌降解溴氨酸及強(qiáng)化體系DNA指紋解析    曲媛媛

麥秸強(qiáng)化油—鹽污染土壤生物修復(fù)過(guò)程研究及場(chǎng)地中試    張坤

景觀水體富營(yíng)養(yǎng)化模擬與生態(tài)修復(fù)技術(shù)研究    劉書宇

臭氧—炭砂濾池對(duì)灤河水深度處理中試研究    段蕾

產(chǎn)氫細(xì)菌培養(yǎng)及模擬發(fā)酵產(chǎn)氫的研究    李建昌

有機(jī)廢水在UASB反應(yīng)器中的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的試驗(yàn)研究    郝小龍

糖蜜廢水制氫系統(tǒng)的調(diào)控及其生物強(qiáng)化    郭子瑞

玉米秸稈預(yù)處理及對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氫效果影響研究    曾召剛

玉米秸稈厭氧發(fā)酵法生產(chǎn)氫氣和甲烷過(guò)程的參數(shù)優(yōu)化    桂曉偉

輸液滅菌工藝中F_0值的研究    閆輝

高濃度有機(jī)廢水厭氧發(fā)酵連續(xù)產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷的試驗(yàn)研究    沈良

脫氫酶在生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程中的規(guī)律與作用研究    馬歡

生物質(zhì)(牛糞、海帶)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的研究    李倬

廚余物厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的研究    許之揚(yáng)