秸稈發(fā)酵制取生化腐殖酸過(guò)程中的理化特性及微生物學(xué)特性研究

【摘要】：我國(guó)的秸稈資源十分豐富,常規(guī)方法是將秸稈發(fā)酵作為有機(jī)肥,利用秸稈發(fā)酵制取生化腐殖酸,既可減少環(huán)境污染,又可得到高附加值的生化腐殖酸產(chǎn)品,從而提高秸稈資源化利用率。本研究探討了稻草段+尿素、稻草粉+尿素、稻草段+牛糞、稻草粉+牛糞四種處理在發(fā)酵過(guò)程中的理化性質(zhì)、秸稈組分化、腐殖質(zhì)形成和微生物類(lèi)群特征,取得了以下結(jié)果。 發(fā)酵過(guò)程中,4種處理的理化性質(zhì)發(fā)生了系列變化。堆料顏色逐漸由黃色或黃棕色轉(zhuǎn)化成棕黑色；發(fā)酵最高溫度達(dá)74℃,高溫階段(≥55℃)持續(xù)了25d；發(fā)酵料pH呈現(xiàn)出先降低再升高的趨勢(shì),發(fā)酵結(jié)束后物料pH為7.92-8.08。 各處理中溫和高溫微生物數(shù)量細(xì)菌放線菌真菌。發(fā)酵結(jié)束后,中溫細(xì)菌數(shù)量介于1.10×109～1.32×109cfu·g-1,中溫放線菌數(shù)量介于1.10×106～1.22×106cfu·g-1;中溫真菌數(shù)量介于4.33×103～5.64×103cfu·g-1之間。各處理的高溫細(xì)菌數(shù)量介于2.99×108～4.6×108cfu·g-1,高溫放線菌數(shù)量介于7.81×105～8.21×105cfu·g-1。而發(fā)酵初期,物料中未能檢測(cè)到高溫真菌；至第30d,各處理高溫真菌數(shù)量達(dá)到最高,介于1.25×104～1.52×104cfu·g-1,至發(fā)酵結(jié)束(60d),高溫真菌數(shù)量介于2.47×103～5.00×103cfu·g-1。 不同處理的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而降低。其中,纖維素含量由初始值29.61%-31.99%降至1.24～1.96%,半纖維素含量從初期的24.16%～27.74%降至后期的5.97%-6.42%。木質(zhì)素含量略有減少,由初始的25.28%～25.93%降低至24.76%-25.11%。 水溶性組分含量表現(xiàn)為先增加后降低,由初期4.3%～9.8%增加至17.5%-18.1%,隨后降至9.8%-10.9%。發(fā)酵料的C/N由初始的31.7～32.8下降至13.9-14.7。腐殖質(zhì)含量由初始的55.6g·kg-1～81.3g·kg-1增加到117.3g·kg-1～125.8g·kg-1。富里酸含量由初期的38.2g·kg-1～41.3g·kg-1降低至29.9g·kg-1～33.4g·kg-1,而胡敏酸含量由12.7g.kg-1～34.4g·kg-1增加至81.3g·kg-1～85.8g·kg-1,發(fā)酵料的H/F由0.31-0.83增加到2.49-2.70。 對(duì)4個(gè)處理的腐熟期樣品細(xì)菌群落進(jìn)行了DGGE-PCR分析,結(jié)果表明,處理Ⅰ和Ⅱ的條帶數(shù)為22,處理Ⅲ和Ⅳ的條帶數(shù)為20；對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行多樣性指數(shù)分析,結(jié)果顯示,處理Ⅰ和Ⅱ細(xì)菌豐度和多樣性指數(shù)高于處理Ⅲ和Ⅳ。對(duì)DGGE條帶克隆測(cè)序,結(jié)果表明,樣品中的細(xì)菌主要有蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.).假單胞菌屬(Pseudomonas sp.).未可培養(yǎng)屈撓桿菌科(UnculturedFlexibacteraceae bacterium),其余為未培養(yǎng)菌(Uncultured bacterium)。這些菌屬于γ變形菌門(mén)(γ-proteobacteria),α變形菌門(mén)(α-proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)。 采用454焦磷酸測(cè)序?qū)μ砑幽蛩睾团＜S的兩種秸稈發(fā)酵樣品(處理Ⅰ對(duì)應(yīng)S1；處理Ⅳ對(duì)應(yīng)S2)的細(xì)菌類(lèi)群進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,在門(mén)、綱、目、科、屬的分類(lèi)水平上,兩個(gè)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌群不同。主要集中在變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes);S1和S2的變形桿菌門(mén)類(lèi)群比例分別為31.62%和35.81%,擬桿菌門(mén)比例分別占27.41%和35.29%。此外,S1中厚壁菌門(mén)(Firmicutes)占18.15%,unclassified Bacteria占8.80%,柔膜菌門(mén)(Tenericutes)占7.28%,其他門(mén)占6.74%；而在S2中,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)占3.43%,unclassified Bacteria數(shù)量占9.63%,浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)占7.06%,其他門(mén)的細(xì)菌占8.78%。 在屬的分類(lèi)水平,在≥1%比例上,S1中有17個(gè)屬,S2有13個(gè)屬。樣品S1主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、無(wú)膽甾原體屬(Acholeplasma)、Alkaliflexus、Sulfurimonas、 Petrimonas、Serprns、Tissierella、Sedimentibacter、密螺旋體屬(Treponema)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)、Sphingopyxis、Saccharofermentans、梭菌屬(Clostridium)、螺旋體屬(Spirochaeta)、脫硫單胞菌屬(Desulfuromonas)、Luteimonas、Pusillimonas,S2中主要有Acholeplasma、Alkaliflexus、Sphingopyxis、Devosia、Methylobacillus、Steroidobacter、 Aequorivita、Arenibacter、Rhodopirellula、Vitellibacter、Lysobacter、Crocinitomix、 Blastopirellua。在≥1%比例上,僅Acholeplasma、 Alkaliflexus、Sphingopyxis三個(gè)屬為兩個(gè)樣品共有的類(lèi)群。在兩處理樣品中,top10的OTUs中沒(méi)有共同的單元,說(shuō)明發(fā)酵料添加牛糞和尿素對(duì)細(xì)菌類(lèi)群影響大,導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)類(lèi)群完全不同。 本研究結(jié)果表明,應(yīng)用不同外加氮源,秸稈發(fā)酵形成生化腐殖酸過(guò)程中,盡管發(fā)酵溫度等參數(shù)、秸稈降解率、腐解物中的腐殖質(zhì)含量及其組分不存在顯著差異,但微生物類(lèi)群顯著不同,且添加尿素的秸稈發(fā)酵物料細(xì)菌類(lèi)群多樣性高于添加牛糞的處理,說(shuō)明在不同環(huán)境中,參與腐殖酸形成與轉(zhuǎn)化的微生物群落呈現(xiàn)多樣化。 【關(guān)鍵詞】：秸稈發(fā)酵 降解率 生化腐殖酸 DGGE 454焦磷酸測(cè)序 微生物類(lèi)群
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：S141
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-44
• 1.1 前言13-14
• 1.2 秸稈發(fā)酵腐解研究進(jìn)展14-23
• 1.2.1 我國(guó)秸稈現(xiàn)狀14-16
• 1.2.2 秸稈的成分及結(jié)構(gòu)16-18
• 1.2.3 秸稈發(fā)酵腐解過(guò)程及其影響因素18-19
• 1.2.4 秸稈發(fā)酵腐解工藝19-20
• 1.2.5 秸稈發(fā)酵腐解的微生物過(guò)程20-21
• 1.2.6 影響秸稈腐解的因素21-23
• 1.2.7 發(fā)酵腐解處理存在的問(wèn)題23
• 1.3 腐殖質(zhì)研究進(jìn)展23-35
• 1.3.1 腐殖質(zhì)形成27-28
• 1.3.2 腐殖質(zhì)的分離與組分28-30
• 1.3.3 生化腐植酸30-32
• 1.3.4 堆肥發(fā)酵過(guò)程中腐殖質(zhì)的變化32-34
• 1.3.5 腐殖酸的應(yīng)用34-35
• 1.4 秸稈發(fā)酵腐解過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展35-42
• 1.4.1 微生物多樣性研究方法35-40
• 1.4.1.1 傳統(tǒng)的微生物研究方法35-36
• 1.4.1.2 BIOLOG微平板方法36-37
• 1.4.1.3 PLFA圖譜分析37-38
• 1.4.1.4 分子生物學(xué)方法38-40
• 1.4.2 堆肥發(fā)酵過(guò)程中微生物類(lèi)群動(dòng)態(tài)變化研究40-42
• 1.5 本課題研究意義及內(nèi)容42-44
• 1.5.1 研究意義42-43
• 1.5.2 研究?jī)?nèi)容43-44
• 2 秸稈發(fā)酵生成腐殖酸過(guò)程中的理化特性動(dòng)態(tài)變化44-56
• 2.1 材料與方法44-47
• 2.1.1 原料44
• 2.1.2 秸稈好氧發(fā)酵處理44
• 2.1.3 好氧發(fā)酵操作管理44-45
• 2.1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法45-47
• 2.2 結(jié)果與分析47-54
• 2.2.1 顏色、氣味變化47-48
• 2.2.2 溫度變化48-49
• 2.2.3 水分變化49-50
• 2.2.4 pH變化50
• 2.2.5 可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化50-54
• 2.3 討論54-56
• 3 秸稈發(fā)酵生成腐殖酸過(guò)程中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化及腐殖質(zhì)組分變化56-66
• 3.1 材料與方法56-59
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料56
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法56-59
• 3.2 結(jié)果與分析59-64
• 3.2.1 纖維素含量變化59
• 3.2.2 半纖維素含量變化59-60
• 3.2.3 木質(zhì)素含量變化60
• 3.2.4 水溶性組分60-61
• 3.2.5 C/N變化61-62
• 3.2.6 腐殖質(zhì)含量變化62
• 3.2.7 富里酸含量變化62-63
• 3.2.8 胡敏酸含量變化63
• 3.2.9 H/F變化63-64
• 3.3 討論64-66
• 4 秸稈發(fā)酵生成腐殖酸過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE分析66-80
• 4.1 樣品總DNA提取66-67
• 4.1.1 試劑配制66
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)材料66
• 4.1.3 樣品預(yù)處理66-67
• 4.1.4 DNA粗提取67
• 4.1.5 DNA純化67
• 4.1.6 純化DNA的檢測(cè)67
• 4.2 細(xì)菌群落PCR-DGGE分析67-73
• 4.2.1 試劑配制68-69
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法69-73
• 4.3 結(jié)果與分析73-78
• 4.3.1 樣品總DNA提取及純化效果73-74
• 4.3.2 16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增74
• 4.3.3 DGGE圖譜及多樣性分析74-76
• 4.3.4 條帶克隆測(cè)序分析76-78
• 4.4 討論78-80
• 5 秸稈發(fā)酵生成腐殖酸過(guò)程中細(xì)菌群落454測(cè)序分析80-93
• 5.1 材料與方法80-82
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料80
• 5.1.2 引物設(shè)計(jì)80-81
• 5.1.3 樣本處理81-82
• 5.1.4 上機(jī)測(cè)序82
• 5.2 結(jié)果與分析82-91
• 5.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及有效數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)82-83
• 5.2.2 操作分類(lèi)單元(OTU)分類(lèi)及Alpha評(píng)估83
• 5.2.3 在門(mén)(Phylum)分類(lèi)水平細(xì)菌類(lèi)群變化83-84
• 5.2.4 在綱(Class)分類(lèi)水平細(xì)菌類(lèi)群變化84-85
• 5.2.5 在目(Order)分類(lèi)水平細(xì)菌類(lèi)群變化85-86
• 5.2.6 在科(Family)分類(lèi)水平細(xì)菌類(lèi)群變化86-87
• 5.2.7 在屬(Genus)分類(lèi)水平細(xì)菌類(lèi)群變化87-88
• 5.2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建和屬的分類(lèi)信息88-90
• 5.2.9 樣品中top 10的OTUs分析90-91
• 5.3 討論91-93
• 6 全文結(jié)論93-95
• 7 本研究創(chuàng)新之處95-96
• 參考文獻(xiàn)96-108
• 致謝108-110
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文110

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腐殖酸對(duì)污灌土壤中Cu、Cd、Pb、Zn形態(tài)影響的研究    陳慧;蔣煜峰;袁建梅;展惠英;

腐殖酸對(duì)Tc價(jià)態(tài)影響研究    王波;劉德軍;姚軍;陳曦;姜濤;貫鴻志;宋志鑫;包良進(jìn);張言;周舵;龍浩騎;范顯華;

腐殖酸-金屬離子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征與穩(wěn)態(tài)指標(biāo)的探討    魏世強(qiáng);R.sterberg;

土壤腐殖酸及其對(duì)重金屬化學(xué)與生物行為的影響    劉保峰;

腐殖酸對(duì)高嶺土吸附稀土元素影響的實(shí)驗(yàn)研究    萬(wàn)鷹昕;劉叢強(qiáng);

腐殖質(zhì)和腐殖酸及其作用效果    吳雨華;

不同結(jié)構(gòu)異質(zhì)性的腐殖酸對(duì)極性與非極性芳香族化合物的吸附    孫慧宇;朱東強(qiáng);毛敬冬;

微生物降解褐煤產(chǎn)生的腐殖酸的生物活性研究    袁紅莉;王風(fēng)芹;李寶珍;陳文新;

阜康打造全國(guó)最大腐殖酸生產(chǎn)基地    通訊員于秀娟

政府部門(mén)聯(lián)打 媒體跟進(jìn)助威    通訊員 李海歐 記者 石遠(yuǎn)峰 錢(qián)海山

神東天隆集團(tuán)一期10萬(wàn)噸腐殖酸項(xiàng)目投產(chǎn)    記者 李林 通訊員 俞瑞娟

桉樹(shù)將有腐殖酸有機(jī)專(zhuān)用肥    福建省林業(yè)科學(xué)研究院

專(zhuān)家提醒 葉面肥不能當(dāng)藥用    劉茹馥

霍市資源精深加工水平不斷提升    席向榮

肥料的種類(lèi)及其施用（三）    高俊楊 弭云祿

霍市全力打造蒙東地區(qū)產(chǎn)業(yè)隆起帶    商海陸

由煤老大向大化工的嬗變    本報(bào)記者 楊朝東 通訊員 胡秀軍 王勇 趙宇明

玉米高產(chǎn)擂臺(tái)賽花落“澳佳”    姜文帥

秸稈發(fā)酵制取生化腐殖酸過(guò)程中的理化特性及微生物學(xué)特性研究    侯勇

水體中重金屬、腐殖酸和粘土顆粒物之間的相互作用研究    李穎

土壤腐殖酸性質(zhì)及其化學(xué)傳感器的研究    鐘桐生

腐殖酸與多環(huán)芳烴的非共價(jià)結(jié)合機(jī)制研究    何盈盈

密云水庫(kù)沉積物中腐殖酸特征及其與重金屬吸附作用研究    朱先芳

土壤腐殖酸與酶蛋白相互作用的機(jī)制    李艷

高分子鋁鹽優(yōu)化混凝控制水中腐殖酸特性研究    吳珍

腐殖酸與幾種重金屬離子的相互作用及影響因素研究    李光林

腐殖酸對(duì)納米零價(jià)鐵修復(fù)污染物的抑制及抗抑制機(jī)理研究    納曼

不同級(jí)分腐殖酸的分子結(jié)構(gòu)特征及其對(duì)菲的吸附行為的影響    李麗

二氧化鈦光催化氧化腐殖酸的實(shí)驗(yàn)研究    徐潔

三氯乙烯在包氣帶介質(zhì)中的吸附行為特征研究    張晶

可溶性有機(jī)質(zhì)對(duì)土霉素在土壤中吸附能力的影響    劉葉

硫肟醚菊酯在土壤中的吸附行為及機(jī)理研究    羅玲

電噴霧質(zhì)譜和釕離子催化氧化法研究腐殖酸分子結(jié)構(gòu)特征    馮瑞華

有機(jī)物料及微生物對(duì)土壤腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究    付杰奇

重慶市主城區(qū)垃圾焚燒廠和垃圾填埋場(chǎng)滲濾液水質(zhì)研究    張宇飛

不同腐殖酸用量對(duì)土壤性狀及煙葉品質(zhì)的影響    凌愛(ài)芬

神府超細(xì)煤粉的光催化氧化性能研究    姜玉鳳

褐煤草碳的吸附解吸特性及生產(chǎn)腐殖酸緩效肥的效應(yīng)研究    劉方春