詹氏甲烷球菌NifH1和釀酒酵母Ndl1的克隆、表達、純化及初步晶體學(xué)分析

【摘要】：1固氮作用是由固氮菌中的固氮復(fù)合物完成的。固氮復(fù)合物由固氮酶和固氮還原酶組成,其中固氮酶是一個由NifD和NifK蛋白組成的α2β2異四聚體,固氮還原酶是一個由NifH蛋白組成的同二聚體。目前,已經(jīng)在沒有固氮作用的嗜熱產(chǎn)烷生物詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)中發(fā)現(xiàn)了固氮酶NifD/K和NifH同源物的表達(命名為NflD/K和NlfH,Nfl=Nif-like,M. jannaschii中的NlfH在這里被稱作Mj.NifH1),但是其功能還不清楚。解出Mj.NifH1的晶體結(jié)構(gòu)將對我們理解其功能以及了解其在進化上的作用提供很大的幫助。 在本課題中,我們構(gòu)建了Mj.NifH1的表達載體,并通過鎳柱親和和HiLoad 16/60 Superdex 200 size-exclusion column凝膠層析等方法得到了純化后的目的蛋白。目的蛋白通過懸滴氣相擴散法在287K進行晶體生長,并得到可以進行X射線衍射和數(shù)據(jù)收集的蛋白晶體。在上海同步輻射加速器收集到一套最高分辨率為3.3 ?的衍射數(shù)據(jù)。晶體的空間群是P4132,晶胞參數(shù)為a = b = c =139.45 ?,確定每個不對稱單位含有一個蛋白分子。 2動力蛋白(Dynein)是一種細胞中的馬達蛋白,可以將包含ATP在內(nèi)的化學(xué)能轉(zhuǎn)換為運動過程中的機械能,在有絲分裂、膜轉(zhuǎn)運和胞內(nèi)運輸中起著關(guān)鍵作用。動力蛋白作用的發(fā)揮需要許多蛋白的共同協(xié)調(diào)作用,如NUDEL家族中的一員Ndl1,對于動力蛋白正常地定位到動粒上非常關(guān)鍵。Ndl1可以激活動力蛋白調(diào)節(jié)的蛋白轉(zhuǎn)運,而當(dāng)它結(jié)合到分裂激素和動力蛋白時,可以穩(wěn)定動力蛋白或動力蛋白激活蛋白,使其不會進行微管依賴的脫落過程,從而進一步產(chǎn)生分子馬達的作用。Ndl1缺失時會導(dǎo)致結(jié)合到微管正極的動力蛋白減少,從而影響有絲分裂等過程。 在本課題中,為獲得釀酒酵母中Ndl1蛋白(Sc.Ndl1)的晶體結(jié)構(gòu),為進一步了解其發(fā)揮功能的分子機制提供線索,我們構(gòu)建了Sc.Ndl1的表達載體,并表達、純化得到目的蛋白,并進行晶體生長。目前得到一顆Sc.Ndl1蛋白晶體,晶體優(yōu)化正在進行中。 【關(guān)鍵詞】：固氮酶 NifH 詹氏甲烷球菌 有絲分裂 動力蛋白 Ndl1 釀酒酵母
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：TS261.1
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一篇 詹氏甲烷球菌 NifH1 的初步晶體學(xué)研究10-47
• 第一章 研究背景概述10-24
• 1.1 固氮作用10-12
• 1.1.1 氮的重要作用以及氮循環(huán)10-12
• 1.1.2 固氮的形式及意義12
• 1.2 固氮酶系統(tǒng)12-15
• 1.3 固氮機制15-16
• 1.4 固氮酶同源物16-20
• 1.5 詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii）中NifH 蛋白的研究進展20-24
• 1.5.1 詹氏甲烷球菌簡介20
• 1.5.2 Mj.NifH1 和Mj.NifD 在體內(nèi)的表達情況20-21
• 1.5.3 Mj.NifH1 和Mj.NifH2 的介紹及對比21-22
• 1.5.4 Mj.NifH 和Mj.NifD 在進化上的重要意義22-23
• 1.5.5 Mj.NifH 結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究意義及進展23-24
• 第二章 實驗材料與方法24-32
• 2.1 質(zhì)粒構(gòu)建24-26
• 2.1.1 引物設(shè)計24
• 2.1.2 PCR 進行目的基因片段的擴增24-25
• 2.1.3 PCR 產(chǎn)物的回收、酶切以及連接到載體25
• 2.1.4 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli TOP10 菌株中25
• 2.1.5 質(zhì)粒的抽提與鑒定25-26
• 2.1.6 PCR 和雙酶切鑒定質(zhì)粒26
• 2.2 目的蛋白的表達純化26-30
• 2.2.1 先用5ml 的LB 小管小量培養(yǎng)以摸索表達條件27
• 2.2.2 擴大培養(yǎng)27
• 2.2.3 蛋白純化27-30
• 2.3 晶體的篩選和優(yōu)化30-31
• 2.3.1 蛋白質(zhì)晶體生長原理30
• 2.3.2 晶體初篩30-31
• 2.3.3 晶體優(yōu)化31
• 2.4 晶體X 射線衍射數(shù)據(jù)的收集和處理31-32
• 2.4.1 衍射數(shù)據(jù)收集31
• 2.4.2 結(jié)構(gòu)解析31-32
• 第三章 實驗結(jié)果與討論32-42
• 3.1 Mj.NifH1 全長基因的克隆和質(zhì)粒構(gòu)建32
• 3.2 Mj.NifH1 的表達純化32-34
• 3.2.1 小量表達以摸索表達條件的結(jié)果32
• 3.2.2 鎳柱純化的結(jié)果32-33
• 3.2.3 液相色譜層析的結(jié)果33-34
• 3.3 Mj.NifH1 的晶體生長34-36
• 3.3.1 Mj.NifH1 的晶體生長濃度條件摸索34-35
• 3.3.2 Mj.NifH1 的晶體初篩35
• 3.3.3 Mj.NifH1 的晶體優(yōu)化35-36
• 3.4 Mj.NifH1 晶體結(jié)構(gòu)的解析工作36-37
• 3.4.1 衍射數(shù)據(jù)收集36-37
• 3.4.2 晶體結(jié)構(gòu)解析37
• 3.5 Mj.NifH1 蛋白性質(zhì)分析37-42
• 3.5.1 動態(tài)光散射檢測蛋白聚集狀態(tài)37-38
• 3.5.2 原子吸收光譜檢測Fe 元素38-42
• 小結(jié)42-43
• 參考文獻43-47
• 第二篇 釀酒酵母 Ndl1 蛋白的初步晶體學(xué)研究47-69
• 第一章 研究背景概述47-56
• 1.1 細胞周期簡介47-48
• 1.2 有絲分裂過程48-50
• 1.3 動力蛋白的結(jié)構(gòu)和功能50-52
• 1.3.1 動力蛋白的結(jié)構(gòu)51
• 1.3.2 細胞質(zhì)動力蛋白的功能51-52
• 1.4 Ndl1 蛋白在動力蛋白調(diào)控中的作用52-56
• 1.4.1 動力蛋白調(diào)控蛋白52
• 1.4.2 釀酒酵母Ndl1 的特征52-53
• 1.4.3 Ndl1 在細胞周期中的出現(xiàn)情況53-54
• 1.4.4 Ndl1 的功能54-56
• 第二章 實驗材料與方法56-60
• 2.1 質(zhì)粒構(gòu)建56
• 2.2 蛋白表達與純化56-57
• 2.2.1 蛋白小量表達條件摸索56
• 2.2.2 擴大培養(yǎng)56
• 2.2.3 蛋白純化56-57
• 2.3 晶體生長57
• 2.4 質(zhì)粒改造57-59
• 2.4.1 設(shè)計質(zhì)粒改造方法58
• 2.4.2 構(gòu)建改造表達載體58-59
• 2.5 改造后重組蛋白的表達純化59-60
• 第三章 實驗結(jié)果及討論60-65
• 3.1 全長蛋白表達及純化60-61
• 3.1.1 小量表達結(jié)果60
• 3.1.2 蛋白純化結(jié)果60-61
• 3.2 改造基因的克隆、蛋白表達和純化61-62
• 3.2.1 改造基因的克隆61-62
• 3.3 改造后重組蛋白Ndl1△79 的表達純化62-64
• 3.3.1 Ndl1△79 的小量表達結(jié)果62
• 3.3.2 Ndl1△79 的純化結(jié)果62-64
• 3.4 Ndl1△79 蛋白晶體生長64-65
• 小結(jié)65-66
• 參考文獻66-69
• 附錄69-74
• 致謝74-75
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的研究成果75

您可以在本站搜索以下學(xué)術(shù)論文文獻來了解更多相關(guān)內(nèi)容

固氮酶催化機制及化學(xué)模擬生物固氮研究進展    王友紹,李季倫

阿托品對中國倉鼠V79細胞有絲分裂過程的影響    和智君,汪旭

線粒體與細胞凋亡    徐忠東,彭景中

Cu~(2+)脅迫誘導(dǎo)花鰱血細胞凋亡的研究    袁鷺;周傳江;蒲德永;

《細胞生物學(xué)》緒論課教學(xué)實踐與探討    侯麗霞;劉新;張玉喜;楊洪兵;

植物細胞凋亡機理的研究    康潔,余曉麗

流式細胞儀在果樹作物倍性鑒定上的應(yīng)用    朱道圩;楊宵;理莎莎;符真珠;毛俊;

復(fù)合酶降解玉米秸稈工藝條件的研究    陳合;張強;趙燕;

長春花內(nèi)生真菌的分離及鑒定    石岳香;周敏;唐忠海;饒力群;

蘿卜愈傷細胞凋亡的初步研究    鄧為科;蔡奇英;鄧為彬;葛剛;洪一江;

中藥復(fù)方多糖的急性毒性研究    張明;

不同劑量~(60)Co輻照對小麥葉片保護酶活性的影響    呂金印;陸璃;高俊鳳;

三疣梭子蟹第一次卵巢發(fā)育過程中卵母細胞和卵泡細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察    楊筱珍;吳旭干;姚桂桂;成永旭;王春琳;

人肺腺癌細胞SPC-A-1與人正常肺WI-38對納米顆粒吞噬作用的比較研究    馬勇杰;李紅;許凱黎;古宏晨;

玉竹內(nèi)生真菌的分離鑒定及其化學(xué)成分的初步研究    潘景芝;許延鐸;王琦;

中國蕈菌產(chǎn)品研究    余杰;

愛普里諾霉素對N2a細胞增殖的影響    張銀花;李秋明;孫英健;

α-皰疹病毒與宿主細胞骨架相互作用的研究進展    劉超;邱亞峰;馬志永;

幼畜與成年畜超排卵發(fā)育潛能差異研究進展    張艷普;桑潤滋;孫樹春;田樹軍;

遺傳學(xué)與細胞生物學(xué)教學(xué)中交叉滲透問題的探討    時麗冉;白麗榮;

哈維氏弧菌VHH溶血素對牙鲆組織細胞的侵染作用及誘導(dǎo)細胞凋亡作用研究    白方方

納米氧化鋅對海馬神經(jīng)元電生理特性的影響及對PC12細胞生物學(xué)效應(yīng)的機制研究    趙景霞

Hsp90抑制劑—格爾德霉素的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及抗病毒構(gòu)效關(guān)系研究    山廣志

Aurora B對Bacp/Nlp的磷酸化調(diào)控及其參與胞質(zhì)分裂的機制研究    晏杰

膜計算仿生優(yōu)化算法及應(yīng)用研究    趙進慧

姜荊提取物抑菌活性的熱動力學(xué)研究    屈嘯聲

溫度敏感性PNIPAAm-g-PDMS智能表面的制備、性能研究及在細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用    馬丹

肌動蛋白網(wǎng)架體系在粘附培養(yǎng)哺乳動物細胞胞質(zhì)分裂變形中的作用    王立

抗葉酸代謝藥MTX誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形動物模型及其對基因組穩(wěn)定性的影響    關(guān)濤

山羊精液液態(tài)保存過程中精子葡萄糖代謝的研究    邱建華

不同油菜品種硼吸收利用差異與細胞壁組分關(guān)系的研究    潘媛

棉花抗細胞凋亡基因GhDAD1的克隆、定位及表達分析    龔文芳

磷脂酶A1產(chǎn)生菌的選育    司武陽

白細胞圖像語義識別分類的研究    廖甜甜

MGF對骨骼肌衛(wèi)星細胞激活的影響及與其增殖的量效關(guān)系    吳嵽

家蠶凋亡相關(guān)基因BmICAD的表達及其功能研究    馬月

BmCycH基因及其在家蠶中表達特性的研究    江艷

兩種不同來源樺褐孔菌多糖的抗氧化與免疫活性的研究    武永德

二維硅納米模具的制作工藝研究    饒杰

楊樹與玉米細胞周期蛋白基因家族全基因組研究    胡翔

固氮酶及合成氨Fe催化劑中N_2的絡(luò)合位    黃靜偉，張風(fēng)章，許良樹，張鴻圖，萬惠霖，蔡啟瑞

固氮酶活性中心網(wǎng)兜模型研究的回顧和前瞻    吳新濤,盧嘉錫

過渡金屬原子簇中的類芳香性    盧嘉錫,陳志達

固氮酶催化的放H_2反應(yīng)    張振水;吳柏和;李季倫;

化學(xué)探針方法研究固氮酶M－簇和P－簇對的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系    萬惠霖，黃靜偉，張鳳章，周朝暉，張鴻圖，許良樹，蔡啟瑞

釀酒酵母原生質(zhì)體形成和再生的研究    張明，王元君，潘仁瑞

釀酒酵母3-磷酸甘油脫氫酶的誘導(dǎo)、提純和性質(zhì)    蔡敬民,Markus Pietzsch,Manfred Rizzi

影響釀酒酵母電擊轉(zhuǎn)化率的條件    秦玉靜,金建玲,鮑曉明,高東

銅抗性菌株的原生質(zhì)體誘變選育及其吸附能力檢測    尤蘭蘭,王乃富,周波,姚良同,賈樂,閆艷春

利用基因敲除技術(shù)破壞釀酒酵母乙醇脫氫酶Ⅱ基因的初步研究    趙麗娟;王德良;程玉來;周建中;葛邦國;

釀酒酵母與糖化酵母原生質(zhì)體的形成與再生    張華山;余響華;李亞芳;

麥角甾醇對釀酒酵母乙醇產(chǎn)率和耐受性的作用(英文)    周進;儲炬;王永紅;張嗣良;莊英萍;

高效液相色譜法測定釀酒酵母中S-腺苷-L-蛋氨酸    劉堅;崔海容;郭堅;胡德聰;劉恭源;楊廣笑;何光源;

工業(yè)釀酒酵母木糖代謝途徑的建立及酒精發(fā)酵初步研究    郭亭;梁達奉;鮑曉明;

釀酒酵母積累海藻糖條件的研究    柴麗紅;徐磊;

釀酒酵母糖基化過程基因工程改造    周峻崗;祁慶生;王鵬;

釀酒酵母YS2-△adh2-△ald6突變株的構(gòu)建及hxt1基因的過表達    王艷尊;高媛媛;施巧琴;吳松剛;黃建忠;

人自噬基因hATG12在釀酒酵母自噬過程中的作用    何才姑;江澍;樸英杰;

海藻酸鈉-PVA固定化釀酒酵母制備工藝的優(yōu)化    黃祖新;薛亮;羅招城;陳由強;葉冰瑩;陳如凱;

木糖代謝工程在釀酒酵母工業(yè)菌株中的建立    王穎;史文龍;劉向勇;沈煜;鮑曉明;白鳳武;曲音波;

rDNA介導(dǎo)的釀酒酵母穩(wěn)定表達載體的構(gòu)建和應(yīng)用研究    張桂敏;曾毓芳;陳雅蘭;屠俊;馬立新;

纖維乙醇全糖發(fā)酵釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌的研究與開發(fā)    鮑曉明;沈煜;

ADH2等位基因缺失的釀酒酵母雜合子的構(gòu)建    郭曉賢;宋浩雷;江賢章;黃建忠;

黑曲霉IME-216產(chǎn)木聚糖酶的條件優(yōu)化及基因在釀酒酵母中高效表達    徐燕;田寶玉;施巧琴;吳松剛;黃建忠;

葡萄酒釀酒酵母菌種改良探討    黃利華;劉欣;張業(yè)輝;趙力超;

釀酒酵母部分蛋白組圖譜公布    治

美國加快開發(fā)出新型“保健飲品”    徐錚奎

基因測序的進展    邵薇 譯

安琪公司參與制定多項國家標準    記者 徐寧　通訊員 成群

新一代免疫增強劑進軍中國市場    記者 王東生

安琪酵母：立志做國際化、專業(yè)化大公司    

RNA組學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的研究    屈良鵠

安琪酵母越發(fā)越大    記者徐寧、通訊員成群

食品生物技術(shù)學(xué)科國內(nèi)外比較分析(中)    何國慶 張灝

安琪酵母：小產(chǎn)品做出大事業(yè)    本報記者 鐘華林 通訊員 李成群

釀酒酵母海藻糖代謝工程與抗逆性相關(guān)機制研究    池小琴

WEB2基因在釀酒酵母S期檢查點調(diào)控機制中的作用    李新鳴

白念珠菌CaPTC6和CaHXT5基因及釀酒酵母ScATP16基因的功能研究    于立權(quán)

酵母表達鮭魚降鈣素基因載體的構(gòu)建及相關(guān)研究    孫平楠

呋喃喹啉類生物堿白鮮堿體外抗真菌活性及作用機制研究    郭娜

鰈形目魚類生長激素基因的克隆及牙鲆生長激素在釀酒酵母中的表達研究    劉濱

白念珠菌和釀酒酵母菌與TOR信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因功能鑒定    閆智慧

酵母對纖維素乙醇生產(chǎn)中的抑制劑響應(yīng)的系統(tǒng)生物學(xué)研究    李炳志

釀酒酵母耐性機理的代謝組學(xué)研究    李莉莉

多基因轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組工業(yè)釀酒酵母及其在木薯酒精發(fā)酵中的應(yīng)用研究    陽辛鳳

詹氏甲烷球菌NifH1和釀酒酵母Ndl1的克隆、表達、純化及初步晶體學(xué)分析    吳昊

電融合法構(gòu)建海藻糖高產(chǎn)菌株的研究    彭帥

酵母基微生物絮凝劑性能及作用機制研究    劉敏

大豆糖蜜分離及低聚糖生物純化的研究    方偉輝

低劑量鎘誘導(dǎo)酵母細胞氧化損傷的機理研究    羅松年

釀酒酵母1450產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選及單倍體的分離    劉麗麗

腸道病毒71型病毒樣顆粒的制備、純化與鑒定    蔣維

工業(yè)釀酒酵母菌株met10基因敲除及其用于工業(yè)生產(chǎn)可行性的研究    劉波

海藻糖在提高釀酒酵母耐鋁性中的作用    華靖

超氧化物歧化酶在釀酒酵母中的分泌表達    李雪蓮