纖維素功能菌群及其木薯酒糟高效甲烷發(fā)酵技術的研究

【摘要】：含有大量木質纖維素的木薯渣是木薯酒糟厭氧消化過程中的主要底物,它的不溶性和復雜性使其難于降解,因此木薯渣的高效水解是提高木薯酒糟厭氧發(fā)酵性能和產甲烷效率的關鍵。近年來,隨著纖維質底物協(xié)同降解機理的研究,開發(fā)高效木質纖維素分解復合菌群對于木薯渣、甘蔗渣等工農業(yè)廢棄物殘渣向甲烷、氫氣、酒精等高附加值產品轉化具有重要的價值。 本文通過底物限制性培養(yǎng)技術得到一組能夠高效降解纖維質的功能菌群RXS,該菌群能夠在40h內將濾紙和木薯渣降解明顯,CMC酶和木聚糖酶活力分別為38.5U和90.2U。連續(xù)傳代、-80℃冷凍保存半年和90℃高溫處理20min后,該菌群對底物的降解效果和酶活力表達基本不變,表明該菌群穩(wěn)定性良好;利用PCR-DGGE技術分析不同代時的微生物結構并進行初步鑒定。結果發(fā)現(xiàn)條帶基本不變,一些兼性微生物(Beta proteobacterium HMD444)、厭氧微生物(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum strain M18, Therm -anaerovibrio acidaminovorans DSM 6589, and Clostridium sp.strains LDC-8-c12, 5-8, CO6- 72, etc.)和不可培養(yǎng)細菌良好的共存于此體系中。 對該菌群的酶活表達及其關鍵水解酶的酶學特性分析表明,該菌群分泌的胞外水解酶是一組包含木聚糖酶、CMC酶、β-葡萄糖苷酶、微晶纖維素酶、濾紙酶和果膠酶等的多酶復合體系;CMC酶和木聚糖酶的最適反應溫度、pH和酶促反應時間分別為60℃、6.0和10min;溫度和pH穩(wěn)定性較好;同時發(fā)現(xiàn)Mn~(2+)對兩種酶具有激活作用,Fe~(2+)、Cu~(2+)和SDS具有抑制作用。而Mg~(2+)對CMC酶有抑制作用,對木聚糖酶有促進作用。吐溫-80、曲拉通-100、EDTA、K~+、Ca~(2+)、Li+、Ba~(2+)等對CMC酶和木聚糖酶活力影響不明顯。 在該菌群應用于木薯渣的水解過程中,監(jiān)測發(fā)現(xiàn)CMC酶、木聚糖酶、果膠酶等關鍵酶的酶活力分別在第2～3d達到最大值34.4、80.5和15.8U;經過10d的發(fā)酵后,木薯渣中的纖維素、半纖維素及木質素分別降解了79.8%、85.9%和19.4%,且木薯渣的失重高達61.5%;此外,代謝產物主要是乙酸、丁酸、己酸和甘油;而溶解性COD、總糖和總揮發(fā)酸的變化表明第2d時木薯渣的水解率最高。培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件對復合菌群發(fā)酵性能的影響分析表明,復合菌群能夠更好的分解濾紙、棉花等纖維素;而以木薯渣為唯一碳源時,20g/L的添加量分解效率最佳;利用蛋白胨和酵母粉做氮源時的纖維素分解活性遠高于硝酸銨、尿素等無機氮源;在發(fā)酵溫度、接種體積分數(shù)、初始pH、轉速分別為50~60℃、5~10%、5.0~9.0和75~135r/min的范圍內,菌群RXS對纖維質底物的分解能力較強。上述結果表明,該菌群能夠有效地水解木薯燃料酒精生產過程中的廢棄物—木薯渣,并有望用于木薯渣高效沼氣發(fā)酵的前處理中。 在有效體積為3L的水解反應器(CSTR)和13L的高溫厭氧反應器(ASBR)中,考察了菌群RXS和高溫厭氧出水循環(huán)耦合對木薯酒糟水解、產甲烷的影響。結果表明在木薯酒糟廢液與高溫消化液的比例為1:2、通氣量為0.25vvm的水解條件下,經過24h的水解,出水TVFA(乙酸)含量由最初的0.89 g/L累積到3.57 g/L,水解液的累計甲烷產量相比處理0h時提高了17.7%,產氣速率也明顯升高。分析了不同OLR的木薯酒糟單相和兩相甲烷發(fā)酵的產甲烷階段的運行狀況,結果表明單相厭氧發(fā)酵時,OLR在12.0gCOD.L-1.d-1的范圍內,COD去除率在70%左右,TVFA/Talk在0.37附近波動,比產甲烷速率為0.115L CH4/g COD。兩相發(fā)酵時,OLR在20.0gCOD.L-1.d-1范圍內,COD去除率在75%左右,TVFA/Talk在0.20以下,比產甲烷速率為0.128L CH4/g COD。而高于這些OLR時,出水出現(xiàn)酸化現(xiàn)象,反應器運行不正常。這些結果表明通過纖維質水解功能菌群強化木薯渣水解過程的兩相沼氣發(fā)酵工藝,可以提高甲烷產量,并且使產甲烷階段高效穩(wěn)定運行,出水中可能含有更少的酒精發(fā)酵抑制物質。 【關鍵詞】：木薯渣 水解功能菌群 關鍵酶活 發(fā)酵性能 生物強化 兩相沼氣發(fā)酵
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：TS261.9
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 目錄7-10
• 第一章 緒論10-22
• 1.1 發(fā)展木薯燃料乙醇的意義及其木薯酒糟的資源化研究10-12
• 1.1.1 發(fā)展木薯燃料乙醇的意義及其酒糟廢液問題10
• 1.1.2 木薯酒糟廢液的傳統(tǒng)處理方法10-11
• 1.1.3 木薯酒精制造新工藝-木薯酒精沼氣雙發(fā)酵生態(tài)耦聯(lián)工藝及其存在的問題11-12
• 1.2 纖維質廢棄物沼氣發(fā)酵的機理及其高效沼氣發(fā)酵技術研究12-16
• 1.2.1 纖維質底物沼氣發(fā)酵的機理12-13
• 1.2.2 高效厭氧反應器的研究13-14
• 1.2.3 沼氣發(fā)酵的過程控制與優(yōu)化14-15
• 1.2.4 纖維質底物高效厭氧消化工藝的研究15-16
• 1.3 纖維質廢棄物水解強化技術研究16-17
• 1.3.1 纖維質水解的物理強化16
• 1.3.2 纖維質底物水解的化學強化16-17
• 1.3.3 纖維質底物水解的生物強化17
• 1.4 纖維質水解微生物資源及其水解酶系統(tǒng)的研究17-20
• 1.4.1 純培養(yǎng)微生物的研究17-18
• 1.4.2 纖維質分解復合菌群的研究18-19
• 1.4.3 纖維素水解機理及其水解酶復合體系的研究19-20
• 1.5 本論文的研究意義與主要內容20-22
• 1.5.1 研究意義20-21
• 1.5.2 本論文的主要研究內容21-22
• 第二章 材料與方法22-32
• 2.1 實驗材料22-24
• 2.1.1 主要實驗儀器22
• 2.1.2 主要實驗藥品22-23
• 2.1.3 實驗原料23-24
• 2.1.4 甲烷發(fā)酵流程圖24
• 2.2 實驗方法24-29
• 2.2.1 纖維質水解菌群的富集篩選24
• 2.2.2 水解菌群的分解性能穩(wěn)定性實驗24-25
• 2.2.3 PCR-DGGE 技術分析菌群結構穩(wěn)定性及其優(yōu)勢微生物的初步鑒定25-26
• 2.2.4 纖維質水解菌群的復合酶系表達及其關鍵水解酶的酶學特性分析26-27
• 2.2.5 纖維質水解菌群分解木薯渣的發(fā)酵特性分析27
• 2.2.6 培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件對菌群水解性能的影響27-28
• 2.2.7 高溫厭氧ASBR 反應器處理木薯酒糟廢液的啟動和運行28
• 2.2.8 纖維質分解菌群和高溫厭氧出水循環(huán)的耦合對木薯酒糟水解產甲烷的影響28-29
• 2.3 實驗主要分析項目及測定方法29-32
• 2.3.1 底物失重率和底物分解速率29
• 2.3.2 pH 和ORP 的測定29
• 2.3.3 生物量的測定29
• 2.3.4 木薯渣成分分析29
• 2.3.5 COD 和sCOD 的測定29-30
• 2.3.6 總糖的測定30
• 2.3.7 總VFA 的測定30
• 2.3.8 酶活力的測定30
• 2.3.9 氨氮、總N 和凱氏氮的測定30
• 2.3.10 甲烷體積的測定30
• 2.3.11 小分子代謝產物的測定30
• 2.3.12 堿度的測定30-32
• 第三章 結果與討論32-69
• 3.1 纖維質水解功能菌群的構建、穩(wěn)定性分析及其初步鑒定32-38
• 3.1.1 纖維質水解菌群的構建結果32-33
• 3.1.2 水解菌群RXS 的分解性能穩(wěn)定性33-35
• 3.1.3 PCR-DGGE 技術分析菌群的結構穩(wěn)定性及其優(yōu)勢微生物的初步鑒定35-37
• 3.1.4 小結37-38
• 3.2 纖維質水解菌群RXS 的復合酶系表達及其關鍵水解酶的酶學特性分析38-42
• 3.2.1 菌群RXS 的胞外水解酶分泌表達狀況38-39
• 3.2.2 粗酶液中關鍵水解酶的最適反應溫度及其溫度穩(wěn)定性研究39-40
• 3.2.3 粗酶液中關鍵水解酶最適反應pH 及其pH 穩(wěn)定性研究40-41
• 3.2.4 酶促反應時間對酶活力的影響41
• 3.2.5 金屬離子、表面活性劑及其螯合劑對酶活力的影響41-42
• 3.2.6 小結42
• 3.3 纖維質水解菌群RXS 分解木薯渣的發(fā)酵特性分析42-48
• 3.3.1 pH、ORP 和生物量的變化42-44
• 3.3.2 關鍵水解酶活力的變化44
• 3.3.3 復合菌群對木薯渣降解效果的影響44-46
• 3.3.4 復合菌群分解木薯渣過程中C 源和N 源物質的變化分析46
• 3.3.5 復合菌群分解木薯渣過程中水解液中可溶性物質分析46-47
• 3.3.6 小結47-48
• 3.4 培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件對菌群RXS 水解纖維質底物效果的影響48-55
• 3.4.1 菌群對不同纖維質底物分解效果的比較48-49
• 3.4.2 碳源添加量對復合菌群發(fā)酵性能的影響49
• 3.4.3 氮源種類對復合菌群發(fā)酵性能的影響49-50
• 3.4.4 培養(yǎng)溫度對復合菌群水解木薯渣的影響50-51
• 3.4.5 接種體積分數(shù)對菌群水解效果的影響51-52
• 3.4.6 初始pH 對復合菌群水解木薯渣的影響52-53
• 3.4.7 轉速對復合菌群水解木薯渣的影響53-55
• 3.4.8 小結55
• 3.5 纖維質分解菌群RXS 強化木薯酒糟水解產甲烷過程的研究55-60
• 3.5.1 水解過程中通氣量的確定55-56
• 3.5.2 高溫厭氧出水回流比的確定56-57
• 3.5.3 木薯酒糟水解過程中胞外水解酶的分泌57
• 3.5.4 木薯酒糟水解過程中水解液特性分析57-59
• 3.5.5 不同水解時間下甲烷產生狀況的變化59
• 3.5.6 小結59-60
• 3.6 不同OLR 的木薯酒糟單相和兩相甲烷發(fā)酵的對比分析60-65
• 3.6.1 甲烷發(fā)酵出水特性對比分析60-61
• 3.6.2 厭氧出水中sCOD、總糖和VFA 的變化61-62
• 3.6.3 厭氧出水中總氮和氨氮濃度的分析62-63
• 3.6.4 不同OLR 的酒糟單相和兩相甲烷發(fā)酵時日產氣量的對比分析63-64
• 3.6.5 比產甲烷速率分析64-65
• 3.6.6 小結65
• 3.7 討論65-69
• 3.7.1 纖維質分解復合菌群和纖維質資源的利用65-66
• 3.7.2 兩相分離提高纖維質廢棄物甲烷化的分析66
• 3.7.3 “微好氧水解”降低回用水中酒精發(fā)酵抑制物質的有效性66-69
• 主要結論與展望69-72
• 主要結論69-70
• 展望70-72
• 致謝72-73
• 參考文獻73-79
• 附錄：作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文79

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烏鱧（Channa argus）腸道壁菌群多態(tài)性及一株腸道菌特性研究    于海羅

豬腸道復合益生菌研究與開發(fā)    陳波

可降解纖維素的微生物菌群篩選及其性質初探    于潔

應用454測序技術分析菌群結構的方法學研究    華蔚穎

高效石油烴降解菌劑的制備及其在溢油污染海岸線生物修復中的應用    楊仕美

維吾爾族血糖異常人群腸道菌群結構特征的ERIC-PCR指紋圖譜分析    張雪雁

有機碳對硝化作用及其菌群結構的影響    劉強