香菇漆酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及對(duì)三苯甲烷類染料脫色的研究

【摘要】：漆酶是一類含銅的多酚氧化酶,一般含有4個(gè)銅原子,這4個(gè)銅離子處于漆酶的活性部位,在催化氧化反應(yīng)中起決定作用。漆酶能催化氧分子4個(gè)電子還原成水,并且伴隨著一些酚類和芳香類底物的氧化。它是白腐真菌三大木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)中的一種,由于其氧化底物時(shí)無(wú)需大量的H202作為輔助劑,且能把分子氧直接還原為水,不會(huì)造成二次污染的特點(diǎn),使得它具有更大的潛在的工業(yè)價(jià)值,常被應(yīng)用于環(huán)境有機(jī)污染物的降解、染料的脫色、造紙工業(yè)的漂白以及生物檢測(cè)等領(lǐng)域。香菇作為一種白腐真菌,能夠分泌出較多的漆酶,并對(duì)染料有脫色作用。但是香菇菌株在人工或者天然培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)漆酶合成水平仍然偏低,而且培養(yǎng)較為困難,發(fā)酵產(chǎn)物成分復(fù)雜,也不便于漆酶的大規(guī)模工業(yè)化制備。因此,開展真菌漆酶的基因克隆及在異源蛋白高效表達(dá),是解決漆酶酶源短缺的重要途徑。 根據(jù)基因庫(kù)香菇漆酶基因LeLcc1的序列(登錄號(hào)：AB035409),并以提取的香菇cDNA為模板,設(shè)計(jì)7對(duì)引物采用定點(diǎn)突變技術(shù)克隆漆酶基因,同時(shí)消除基因內(nèi)部的BamH I和Sac I位點(diǎn)及5'端18個(gè)氨基酸組成的自身分泌信號(hào)肽序列,得到編碼500個(gè)氨基酸的1503 bp漆酶基因序列,并插入到表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pYM8837。表達(dá)質(zhì)粒含有釀酒酵母α信號(hào)肽序列、克隆的LeLcc1基因以及終止子。重組質(zhì)粒以BglⅡ線性化后電轉(zhuǎn)化進(jìn)GS115菌株。SDS-PAGE分析顯示重組漆酶分子量大小約為62 KD,糖基化率為15.4%。純化后的重組漆酶以ABTS為底物進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,結(jié)果表明重組漆酶在最適pH 2.4,在30℃條件下比較穩(wěn)定,這與野生型漆酶性質(zhì)(Lcc1)不同,但是在其它酶學(xué)性質(zhì)方面相似。它們的最適溫度是45℃,金屬離子如Ba2+、Ca2+、Zn2+和A13+對(duì)它們的活性都有抑制作用,潛在的抑制劑如DTT和NaN3能強(qiáng)烈的抑制它們的活性,蛋白質(zhì)螯合劑—EDTA對(duì)它們活性僅有微弱的抑制作用。L-Alanine作為重組漆酶在畢赤酵母表達(dá)時(shí)維持pH穩(wěn)定的添加劑,具有促進(jìn)漆酶酶活的作用。另外對(duì)重組漆酶搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究,為下一步大規(guī)模的發(fā)酵提供參考。結(jié)果表明BMM培養(yǎng)基最佳的誘導(dǎo)條件添加終濃度為1.5%甲醇和0.2 mM Cu2+。 我們研究了純重組漆酶脫色孔雀石綠、結(jié)晶紫和亮綠,發(fā)現(xiàn)脫色效果不是很明顯,且隨著pH的上升染料脫色率在下降。ABTS是最常用的合成介體,我們對(duì)漆酶ABTS介體系統(tǒng)脫色染料條件進(jìn)行了優(yōu)化：孔雀石綠最佳的脫色條件是pH 2.4-3.0、溫度是40℃和10μMABTS;結(jié)晶紫最佳脫色條件是pH 2.4-3.6、溫度是45℃和10μMABTS;亮綠最佳脫色條件pH 3.0-4.0、溫度是50℃和4μM。 我們以孔雀石綠為底物從8種自然酚類化合物中,篩選出乙酰丁香酮和丁香醛是最有效的介體,它們18h后幾乎能將孔雀石綠完全脫色,結(jié)晶紫和亮綠的脫色率也達(dá)到65%。pH和介體濃度對(duì)染料的脫色有影響,孔雀石綠和結(jié)晶紫最適pH是4.0,而亮綠的最適pH是3.6；三種染料都是在介體/染料比例是6/1時(shí)達(dá)到最大脫色率。另外,HBT是一種最常見的漆酶合成介體,在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)三種染料的脫色都沒有起到介導(dǎo)作用。 【關(guān)鍵詞】：香菇 漆酶 畢赤酵母 三苯甲烷類染料 脫色 介體
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：TQ925;S646.12
【目錄】：

• 目錄4-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 名詞縮寫12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-29
• 1. 白腐菌漆酶13-20
• 1.1 漆酶的概念13
• 1.2 漆酶的來源和分布13
• 1.3 漆酶特性13-18
• 1.4 漆酶的主要用途18-20
• 2. 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)20-23
• 2.1 畢赤酵母表達(dá)要素20-21
• 2.2 影響外源基因在酵母中表達(dá)的因素21-23
• 3. 研究意義23-24
• 參考文獻(xiàn)24-29
• 第二章 香菇漆酶基因克隆表達(dá)及重組漆酶酶學(xué)性質(zhì)29-47
• 第一節(jié) 香菇漆酶基因的克隆表達(dá)30-40
• 1. 材料30
• 1.1 菌株與質(zhì)粒30
• 1.2 試劑30
• 1.3 培養(yǎng)基與緩沖溶液30
• 1.4 主要儀器30
• 2. 方法30-36
• 2.1 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增香菇漆酶基因30-32
• 2.2 表達(dá)載體pYM8837的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化畢赤酵母32-33
• 2.3 表達(dá)載體pYM8837在大腸桿菌DH5a中擴(kuò)增33
• 2.4 畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化33-34
• 2.5 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定34
• 2.6 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)34
• 2.7 漆酶酶活測(cè)定方法34-35
• 2.8 重組漆酶的純化和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析35-36
• 3. 結(jié)果與分析36-39
• 3.1 香菇漆酶基因的克隆36-37
• 3.2 重組畢赤酵母載體的構(gòu)建及酶切鑒定37-38
• 3.3 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定38
• 3.4 重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析38-39
• 4. 討論39-40
• 第二節(jié) 重組漆酶酶學(xué)性質(zhì)40-47
• 1. 材料40
• 2. 方法40-41
• 2.1 酶活的測(cè)定方法40
• 2.2 漆酶最適作用pH測(cè)定40
• 2.3 漆酶的最適反應(yīng)溫度測(cè)定40
• 2.4 酶pH穩(wěn)定性的測(cè)定40-41
• 2.5 酶對(duì)溫度的穩(wěn)定性測(cè)定41
• 2.6 幾種金屬離子對(duì)酶活的影響41
• 2.7 幾種潛在抑制劑對(duì)酶活的影響41
• 3. 結(jié)果與分析41-44
• 3.1 漆酶最適作用pH值和pH穩(wěn)定性41-42
• 3.2 漆酶的最適反應(yīng)溫度42
• 3.3 漆酶的熱穩(wěn)定性研究42-43
• 3.4 幾種金屬離子對(duì)漆酶活力的影響43
• 3.5 幾種潛在抑制劑對(duì)漆酶活性的影響43-44
• 4. 討論44-45
• 5. 本章小結(jié)45-47
• 第三章 重組漆酶搖瓶表達(dá)條件的初步研究47-53
• 1. 材料48
• 1.1 菌株48
• 1.2 培養(yǎng)基48
• 1.3 主要儀器48
• 2. 方法48-49
• 2.1 漆酶活性測(cè)定方法48
• 2.2 酵母細(xì)胞密度分析48
• 2.3 種子活化方法48
• 2.4 漆酶重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)48-49
• 3. 結(jié)果49-50
• 3.1 添加不同濃度的甲醇對(duì)重組酵母漆酶表達(dá)活性的影響49
• 3.2 添加不同濃度Cu~(2+)對(duì)重組酵母漆酶表達(dá)活性的影響49-50
• 4. 討論50-51
• 5. 本章小結(jié)51-53
• 第四章 漆酶介體系統(tǒng)脫色三苯甲烷類染料53-91
• 第一節(jié) 重組漆酶對(duì)孔雀石綠脫色的研究54-67
• 1. 材料54
• 1.1 化學(xué)試劑54
• 1.2 酶及染料54
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器54
• 2. 方法54-55
• 2.1 染料溶液的降解方法54
• 2.2 染料溶液的脫色分析方法54
• 2.3 孔雀石綠的最大吸收波長(zhǎng)54
• 2.4 孔雀石綠HPLC分析方法54-55
• 3. 結(jié)果55-65
• 3.1 純漆酶與孔雀石綠脫色55
• 3.2 漆酶ABTS介體體系對(duì)孔雀石綠脫色的研究55-57
• 3.3 自然酚類化合物作為漆酶介體對(duì)孔雀石綠脫色的研究57-60
• 3.4 ABTS、乙酰丁香酮和丁香醛脫色孔雀石綠掃描圖60-61
• 3.5 孔雀石綠降解高效液相色譜分析61-65
• 4. 討論65-67
• 第二節(jié) 重組漆酶對(duì)結(jié)晶紫脫色研究67-79
• 1. 材料67
• 1.1 化學(xué)試劑67
• 1.2 酶及染料67
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器67
• 2. 方法67-68
• 2.1 染料溶液的降解方法67
• 2.2 染料溶液的脫色分析方法67
• 2.3 結(jié)晶紫的最大吸收波長(zhǎng)67
• 2.4 結(jié)晶紫HPLC分析方法67-68
• 3. 結(jié)果68-77
• 3.1 純漆酶與結(jié)晶紫脫色68
• 3.2 漆酶ABTS介體體系對(duì)結(jié)晶紫的研究68-70
• 3.3 自然酚類化合物作為漆酶介體對(duì)結(jié)晶紫脫色的研究70-72
• 3.4 ABTS,乙酰丁香酮和丁香醛脫色結(jié)晶紫掃描圖72-73
• 3.5 結(jié)晶紫降解高效液相色譜分析73-77
• 4. 討論77-79
• 第三節(jié) 重組漆酶對(duì)亮綠脫色研究79-91
• 1. 材料79
• 1.1 化學(xué)試劑79
• 1.2 酶及染料79
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器79
• 2. 方法79
• 2.1 染料溶液的降解方法79
• 2.2 染料溶液脫色分析方法79
• 2.3 亮綠的最大吸收波長(zhǎng)79
• 2.4 亮綠HPLC分析方法79
• 3. 結(jié)果79-88
• 3.1 純漆酶與亮綠脫色80
• 3.2 漆酶ABTS介體體系對(duì)亮綠的研究80-82
• 3.3 自然酚類化合物作為漆酶介體對(duì)亮綠脫色的研究82-84
• 3.4 ABTS,乙酰丁香酮和丁香醛脫色亮綠掃描圖84-85
• 3.5 亮綠高效液相色譜分析85-88
• 4. 討論88-89
• 5. 本章小結(jié)89-91
• 全文總結(jié)91-93
• 參考文獻(xiàn)93-97
• 附錄97-99
• 致謝99

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乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的組成型表達(dá)    周則迅,袁漢英,何煒,高卜渝,李育陽(yáng)

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木質(zhì)素生物降解過程中木質(zhì)素介體反應(yīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展    閆文超,黃峰,高培基

白腐真菌對(duì)染料的脫色與降解    黃民生,程永前,張國(guó)瑩

人血管抑素在畢氏酵母中的表達(dá)及其活性測(cè)定    辛利,張勵(lì),徐韌,張倩,葉勤,李載平,甘人寶

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不同緩沖體系下pH值對(duì)裂褶菌F17產(chǎn)錳過氧化物酶的影響    李旭東;莢榮;呂颯音;唐文忠;

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糙皮側(cè)耳漆酶基因的克隆及在粟酒裂殖酵母中的表達(dá)    石振飛

香菇漆酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及對(duì)三苯甲烷類染料脫色的研究    周超

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杏鮑菇（Pleurotus eryngii）漆酶基因的體外誘變及在畢赤酵母中表達(dá)    蔣瑾