香菇漆酶基因在畢赤酵母中的表達及對三苯甲烷類染料脫色的研究

【摘要】：漆酶是一類含銅的多酚氧化酶,一般含有4個銅原子,這4個銅離子處于漆酶的活性部位,在催化氧化反應中起決定作用。漆酶能催化氧分子4個電子還原成水,并且伴隨著一些酚類和芳香類底物的氧化。它是白腐真菌三大木質素降解酶系統(tǒng)中的一種,由于其氧化底物時無需大量的H202作為輔助劑,且能把分子氧直接還原為水,不會造成二次污染的特點,使得它具有更大的潛在的工業(yè)價值,常被應用于環(huán)境有機污染物的降解、染料的脫色、造紙工業(yè)的漂白以及生物檢測等領域。香菇作為一種白腐真菌,能夠分泌出較多的漆酶,并對染料有脫色作用。但是香菇菌株在人工或者天然培養(yǎng)基上生長時漆酶合成水平仍然偏低,而且培養(yǎng)較為困難,發(fā)酵產物成分復雜,也不便于漆酶的大規(guī)模工業(yè)化制備。因此,開展真菌漆酶的基因克隆及在異源蛋白高效表達,是解決漆酶酶源短缺的重要途徑。 根據基因庫香菇漆酶基因LeLcc1的序列(登錄號：AB035409),并以提取的香菇cDNA為模板,設計7對引物采用定點突變技術克隆漆酶基因,同時消除基因內部的BamH I和Sac I位點及5'端18個氨基酸組成的自身分泌信號肽序列,得到編碼500個氨基酸的1503 bp漆酶基因序列,并插入到表達載體pPIC9K的多克隆位點中,構建得到重組質粒pYM8837。表達質粒含有釀酒酵母α信號肽序列、克隆的LeLcc1基因以及終止子。重組質粒以BglⅡ線性化后電轉化進GS115菌株。SDS-PAGE分析顯示重組漆酶分子量大小約為62 KD,糖基化率為15.4%。純化后的重組漆酶以ABTS為底物進行酶學性質研究,結果表明重組漆酶在最適pH 2.4,在30℃條件下比較穩(wěn)定,這與野生型漆酶性質(Lcc1)不同,但是在其它酶學性質方面相似。它們的最適溫度是45℃,金屬離子如Ba2+、Ca2+、Zn2+和A13+對它們的活性都有抑制作用,潛在的抑制劑如DTT和NaN3能強烈的抑制它們的活性,蛋白質螯合劑—EDTA對它們活性僅有微弱的抑制作用。L-Alanine作為重組漆酶在畢赤酵母表達時維持pH穩(wěn)定的添加劑,具有促進漆酶酶活的作用。另外對重組漆酶搖瓶發(fā)酵條件進行了初步研究,為下一步大規(guī)模的發(fā)酵提供參考。結果表明BMM培養(yǎng)基最佳的誘導條件添加終濃度為1.5%甲醇和0.2 mM Cu2+。 我們研究了純重組漆酶脫色孔雀石綠、結晶紫和亮綠,發(fā)現脫色效果不是很明顯,且隨著pH的上升染料脫色率在下降。ABTS是最常用的合成介體,我們對漆酶ABTS介體系統(tǒng)脫色染料條件進行了優(yōu)化：孔雀石綠最佳的脫色條件是pH 2.4-3.0、溫度是40℃和10μMABTS;結晶紫最佳脫色條件是pH 2.4-3.6、溫度是45℃和10μMABTS;亮綠最佳脫色條件pH 3.0-4.0、溫度是50℃和4μM。 我們以孔雀石綠為底物從8種自然酚類化合物中,篩選出乙酰丁香酮和丁香醛是最有效的介體,它們18h后幾乎能將孔雀石綠完全脫色,結晶紫和亮綠的脫色率也達到65%。pH和介體濃度對染料的脫色有影響,孔雀石綠和結晶紫最適pH是4.0,而亮綠的最適pH是3.6；三種染料都是在介體/染料比例是6/1時達到最大脫色率。另外,HBT是一種最常見的漆酶合成介體,在本實驗中發(fā)現對三種染料的脫色都沒有起到介導作用。 【關鍵詞】：香菇 漆酶 畢赤酵母 三苯甲烷類染料 脫色 介體
【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：TQ925;S646.12
【目錄】：

• 目錄4-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 名詞縮寫12-13
• 第一章 文獻綜述13-29
• 1. 白腐菌漆酶13-20
• 1.1 漆酶的概念13
• 1.2 漆酶的來源和分布13
• 1.3 漆酶特性13-18
• 1.4 漆酶的主要用途18-20
• 2. 畢赤酵母表達系統(tǒng)20-23
• 2.1 畢赤酵母表達要素20-21
• 2.2 影響外源基因在酵母中表達的因素21-23
• 3. 研究意義23-24
• 參考文獻24-29
• 第二章 香菇漆酶基因克隆表達及重組漆酶酶學性質29-47
• 第一節(jié) 香菇漆酶基因的克隆表達30-40
• 1. 材料30
• 1.1 菌株與質粒30
• 1.2 試劑30
• 1.3 培養(yǎng)基與緩沖溶液30
• 1.4 主要儀器30
• 2. 方法30-36
• 2.1 引物設計及擴增香菇漆酶基因30-32
• 2.2 表達載體pYM8837的構建及轉化畢赤酵母32-33
• 2.3 表達載體pYM8837在大腸桿菌DH5a中擴增33
• 2.4 畢赤酵母的電擊轉化33-34
• 2.5 重組畢赤酵母轉化子的鑒定34
• 2.6 重組畢赤酵母的誘導表達34
• 2.7 漆酶酶活測定方法34-35
• 2.8 重組漆酶的純化和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析35-36
• 3. 結果與分析36-39
• 3.1 香菇漆酶基因的克隆36-37
• 3.2 重組畢赤酵母載體的構建及酶切鑒定37-38
• 3.3 重組畢赤酵母轉化子的鑒定38
• 3.4 重組畢赤酵母表達產物SDS-PAGE分析38-39
• 4. 討論39-40
• 第二節(jié) 重組漆酶酶學性質40-47
• 1. 材料40
• 2. 方法40-41
• 2.1 酶活的測定方法40
• 2.2 漆酶最適作用pH測定40
• 2.3 漆酶的最適反應溫度測定40
• 2.4 酶pH穩(wěn)定性的測定40-41
• 2.5 酶對溫度的穩(wěn)定性測定41
• 2.6 幾種金屬離子對酶活的影響41
• 2.7 幾種潛在抑制劑對酶活的影響41
• 3. 結果與分析41-44
• 3.1 漆酶最適作用pH值和pH穩(wěn)定性41-42
• 3.2 漆酶的最適反應溫度42
• 3.3 漆酶的熱穩(wěn)定性研究42-43
• 3.4 幾種金屬離子對漆酶活力的影響43
• 3.5 幾種潛在抑制劑對漆酶活性的影響43-44
• 4. 討論44-45
• 5. 本章小結45-47
• 第三章 重組漆酶搖瓶表達條件的初步研究47-53
• 1. 材料48
• 1.1 菌株48
• 1.2 培養(yǎng)基48
• 1.3 主要儀器48
• 2. 方法48-49
• 2.1 漆酶活性測定方法48
• 2.2 酵母細胞密度分析48
• 2.3 種子活化方法48
• 2.4 漆酶重組酵母的誘導表達實驗48-49
• 3. 結果49-50
• 3.1 添加不同濃度的甲醇對重組酵母漆酶表達活性的影響49
• 3.2 添加不同濃度Cu~(2+)對重組酵母漆酶表達活性的影響49-50
• 4. 討論50-51
• 5. 本章小結51-53
• 第四章 漆酶介體系統(tǒng)脫色三苯甲烷類染料53-91
• 第一節(jié) 重組漆酶對孔雀石綠脫色的研究54-67
• 1. 材料54
• 1.1 化學試劑54
• 1.2 酶及染料54
• 1.3 實驗儀器54
• 2. 方法54-55
• 2.1 染料溶液的降解方法54
• 2.2 染料溶液的脫色分析方法54
• 2.3 孔雀石綠的最大吸收波長54
• 2.4 孔雀石綠HPLC分析方法54-55
• 3. 結果55-65
• 3.1 純漆酶與孔雀石綠脫色55
• 3.2 漆酶ABTS介體體系對孔雀石綠脫色的研究55-57
• 3.3 自然酚類化合物作為漆酶介體對孔雀石綠脫色的研究57-60
• 3.4 ABTS、乙酰丁香酮和丁香醛脫色孔雀石綠掃描圖60-61
• 3.5 孔雀石綠降解高效液相色譜分析61-65
• 4. 討論65-67
• 第二節(jié) 重組漆酶對結晶紫脫色研究67-79
• 1. 材料67
• 1.1 化學試劑67
• 1.2 酶及染料67
• 1.3 實驗儀器67
• 2. 方法67-68
• 2.1 染料溶液的降解方法67
• 2.2 染料溶液的脫色分析方法67
• 2.3 結晶紫的最大吸收波長67
• 2.4 結晶紫HPLC分析方法67-68
• 3. 結果68-77
• 3.1 純漆酶與結晶紫脫色68
• 3.2 漆酶ABTS介體體系對結晶紫的研究68-70
• 3.3 自然酚類化合物作為漆酶介體對結晶紫脫色的研究70-72
• 3.4 ABTS,乙酰丁香酮和丁香醛脫色結晶紫掃描圖72-73
• 3.5 結晶紫降解高效液相色譜分析73-77
• 4. 討論77-79
• 第三節(jié) 重組漆酶對亮綠脫色研究79-91
• 1. 材料79
• 1.1 化學試劑79
• 1.2 酶及染料79
• 1.3 實驗儀器79
• 2. 方法79
• 2.1 染料溶液的降解方法79
• 2.2 染料溶液脫色分析方法79
• 2.3 亮綠的最大吸收波長79
• 2.4 亮綠HPLC分析方法79
• 3. 結果79-88
• 3.1 純漆酶與亮綠脫色80
• 3.2 漆酶ABTS介體體系對亮綠的研究80-82
• 3.3 自然酚類化合物作為漆酶介體對亮綠脫色的研究82-84
• 3.4 ABTS,乙酰丁香酮和丁香醛脫色亮綠掃描圖84-85
• 3.5 亮綠高效液相色譜分析85-88
• 4. 討論88-89
• 5. 本章小結89-91
• 全文總結91-93
• 參考文獻93-97
• 附錄97-99
• 致謝99

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