孔雀石綠降解菌的分離鑒定、生物學(xué)特性研究及三苯甲烷還原酶基因的克隆和表達(dá)

【摘要】：從某化工廠污水處理池的活性污泥中分離篩選到兩株孔雀石綠降解細(xì)菌,經(jīng)形態(tài)、生理生化特性測(cè)定及16S rRNA基因相似性比較,將它們初步鑒定為Raoultella sp.K4-W (GenBank Accession No. EU876828)和Pseudomonas sp.K9 (GenBank Accession No. EU855781)。 菌株K4-W在pH5.0-10.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好,最適生長(zhǎng)pH為7.0,最適生長(zhǎng)溫度為30℃,木糖為其最適生長(zhǎng)碳源,蛋白胨為其最適生長(zhǎng)氮源；K9在pH為6.0-10.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好,最適生長(zhǎng)pH為7.0,最適生長(zhǎng)溫度也為30℃,麥芽糖為其最適生長(zhǎng)碳源,牛肉膏為其最適生長(zhǎng)氮源。 在含有20mg·L1的孔雀石綠的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,K4-W和K9在48h內(nèi)對(duì)其的降解率分別為82.5%和88.3%。K4-W和K9對(duì)孔雀石綠的最適降解溫度為30℃。高于20mg·L1的孔雀石綠起始濃度會(huì)降低兩株菌的降解率,除Pb2+(0.5mmol·L-1)有促進(jìn)作用外,A13+、Mn2+和Zn2+等都會(huì)抑制K4-W對(duì)孔雀石綠的降解。K9的降解能力卻會(huì)受Cd2+、Mn2+和Mg2+等所有供試金屬離子的抑制。K4-W只能降解孔雀石綠,對(duì)其他三苯甲烷類(lèi)染料無(wú)降解功能；K9除了能降解孔雀石綠以外還能降解結(jié)晶紫及堿性品紅等三苯甲烷類(lèi)染料。 根據(jù)已報(bào)道的三苯甲烷還原酶基因(tmr2)設(shè)計(jì)引物,從K9和K4-W擴(kuò)增該基因。結(jié)果顯示,從K9中能擴(kuò)增到tmr2基因(864bp),通過(guò)在線比對(duì)序列相似性,該基因與Pseudomonas stutzeri MDB-1中的tmr2(GenBank accession No.EF463103)相似性高達(dá)100%,與Citrobacter sp.MY-5中的tmr(GenBank accession No.AY756172)和Aeromonas hydrophila DN322中的tmpD(GenBank accession No.EF010984)相似性為99%。但未從K4-W中擴(kuò)增到該基因,該菌株是否含有新的三苯甲烷還原酶基因,還需進(jìn)一步研究。將tmr2基因構(gòu)建到表達(dá)載體pET29a中,轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá),得到了分子量符合預(yù)期大小的蛋白質(zhì)(31KD),該蛋白具有三苯甲烷還原酶活性,它能夠依賴(lài)輔酶NADH還原孔雀石綠,結(jié)晶紫和堿性品紅。該特性與前人報(bào)道的從Citrobacter sp. MY-5和Pseudomonas stutzeri MDB-1克隆到的tmr基因在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)產(chǎn)物的特性一致。通過(guò)染色體步移(chromosome walking),獲得了tmr2基因上游和下游片段,它們和tmr2基因拼接后的總長(zhǎng)為5946bp。對(duì)其進(jìn)行分析,在上游片段中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有意閱讀框,下游片段包含了一個(gè)典型的移動(dòng)元件ISPpu12,該移動(dòng)元件由tnpA(編碼轉(zhuǎn)座酶),IspA(編碼脂蛋白信號(hào)肽酶)和orfl(編碼CDF家族重金屬離子/H+外排通道蛋白)組成。據(jù)此推測(cè)tmr基因可能是一個(gè)可以在菌株之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移的基因,但還需要進(jìn)一步研究來(lái)證明。 【關(guān)鍵詞】：孔雀石綠 微生物降解 三苯甲烷還原酶基因克隆 移動(dòng)元件
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：X172
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 符號(hào)與縮略語(yǔ)說(shuō)明11-12
• 前言12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-27
• 第一節(jié) 三苯甲烷類(lèi)染料及孔雀石綠簡(jiǎn)介13-18
• 1 三苯甲烷類(lèi)染料概述13-14
• 2 三苯甲烷類(lèi)染料污染及危害14-15
• 3 孔雀石綠的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及用途15-16
• 4 孔雀石綠的危害16-17
• 5 孔雀石綠及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的檢測(cè)17-18
• 5.1 分光光度法17
• 5.2 高效液相色譜法17-18
• 5.3 高效液相色譜-質(zhì)譜法18
• 第二節(jié) 三苯甲烷類(lèi)染料及孔雀石綠的降解研究進(jìn)展18-22
• 1 吸附法18-19
• 2 光催化氧化19-20
• 3 生物法20-21
• 3.1 具有降解脫色能力的真菌20
• 3.2 具有降解脫色能力的細(xì)菌20-21
• 3.3 降解脫色混合菌21
• 4 微生物降解三苯甲烷類(lèi)染料的展望21-22
• 參考文獻(xiàn)22-27
• 第二章 孔雀石綠降解菌的分離、鑒定及其降解特性研究27-49
• 第一節(jié) 孔雀石綠降解菌株K4-W和K9的分離與鑒定27-41
• 1 材料與方法27-29
• 1.1 培養(yǎng)基與試劑27
• 1.2 孔雀石綠降解菌的分離27-28
• 1.3 降解菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定28
• 1.4 降解菌株16S rRNA基因序列的測(cè)定28-29
• 1.5 降解菌株系統(tǒng)發(fā)育地位的確定29
• 1.6 菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定29
• 1.7 孔雀石綠的含量測(cè)定29
• 2 結(jié)果與討論29-40
• 2.1 孔雀石綠降解菌株的分離29-30
• 2.2 降解菌株K4-W和K9的菌落形態(tài)及生理生化特征30-31
• 2.3 菌株K4-W和K9的16S rRNA基因擴(kuò)增31-32
• 2.4 降解菌株K4-W和K9的鑒定結(jié)果32-34
• 2.5 環(huán)境條件對(duì)降解菌株K4-W和K9生長(zhǎng)的影響34-39
• 2.6 菌株K4-W和K9對(duì)抗生素的耐受性39-40
• 3 小結(jié)40-41
• 第二節(jié) 孔雀石綠降解菌株K4-W和K9的降解特性研究41-47
• 1 材料與方法41
• 1.1 培養(yǎng)基與試劑41
• 1.2 菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定41
• 1.3 孔雀石綠及其他染料的含量測(cè)定41
• 1.4 種子液培養(yǎng)41
• 2 結(jié)果與討論41-47
• 2.1 菌株K4-W和K9的生長(zhǎng)和孔雀石綠降解的關(guān)系41-42
• 2.2 孔雀石綠起始濃度對(duì)K4-W和K9降解孔雀石綠的影響42-43
• 2.3 溫度對(duì)K4-W和K9降解孔雀石綠的影響43-44
• 2.4 接種量對(duì)K4-W和K9降解孔雀石綠的影響44-45
• 2.5 金屬離子對(duì)K4.W和K9降解孔雀石綠的影響45-46
• 2.6 K4-W和K9對(duì)不同染料的降解情況46-47
• 3 小結(jié)47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 第三章 三苯甲烷還原酶基因(tmr2)的克隆及表達(dá)49-63
• 1 材料和方法49-54
• 1.1 培養(yǎng)基與試劑49
• 1.2 菌株與質(zhì)粒49-50
• 1.3 菌體基因組DNA的提取50
• 1.4 質(zhì)粒DNA的小量提取50-51
• 1.5 普通感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl_2法)51
• 1.6 三苯甲烷還原酶基因的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增51-52
• 1.7 PCR產(chǎn)物的純化及酶切52
• 1.8 表達(dá)載體pET29a的制備52
• 1.9 酶連及酶連產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化52-53
• 1.10 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析53
• 1.11 酶活分析53-54
• 2 結(jié)果與討論54-60
• 2.1 PCR法克隆三苯甲烷還原酶基因54-55
• 2.2 序列測(cè)定與比較分析55
• 2.3 tmr2基因在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)55-60
• 3 小結(jié)60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 第四章 三苯甲烷還原酶基因(tmr2)的側(cè)翼序列擴(kuò)增及分析63-69
• 1 材料與方法63-65
• 1.1 培養(yǎng)基與試劑63
• 1.2 菌株與質(zhì)粒63
• 1.3 菌體基因組DNA和質(zhì)粒DNA的提取63-64
• 1.4 側(cè)翼序列SEFA-PCR引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增64-65
• 1.5 PCR產(chǎn)物的TA克隆65
• 1.6 序列分析65
• 2 結(jié)果與討論65-66
• 2.1 tmr2基因側(cè)翼序列的擴(kuò)增及分析65-66
• 3 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-69
• 全文總結(jié)69-71
• 附錄一 文中所用培養(yǎng)基及試劑配方71-73
• 附錄二 相關(guān)DNA序列73-79
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表或已接收的論文79-81
• 致謝81

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孔雀石綠與牛血清白蛋白的相互作用    曹團(tuán)武;楊季冬;

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水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測(cè)及殘留提取技術(shù)研究    曹慧;管驍;張小剛;徐斐;

珠海市餐廳池養(yǎng)水產(chǎn)品及池水中孔雀石綠殘留量的調(diào)查    王麗玲;馮翠霞;胡爾萍;梁玉英;白艷玲;張彩虹;陳琦;

高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定魚(yú)肉中孔雀石綠及隱性孔雀石綠的含量    龍朝陽(yáng);朱炳輝;許秀敏;黃湘東;魯琳;高燕紅;

孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物在南美白對(duì)蝦體內(nèi)的殘留與消除規(guī)律    陳培基;李劉冬;楊金蘭;黎智廣;王強(qiáng);楊宏亮;

底泥中孔雀石綠及其代謝物高效液相色譜檢測(cè)方法    俞道進(jìn);余培建;樊海平;黃一帆;

應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)孔雀石綠對(duì)細(xì)胞DNA的損傷    吳永魁;周艷紅;沈建忠;

孔雀石綠及其主要代謝產(chǎn)物在歐洲鰻鱺肌肉中的蓄積及消除規(guī)律    高露姣;蔡友瓊;姜朝軍;錢(qián)蓓蕾;于慧娟;徐捷;

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水中孔雀石綠和隱色孔雀石綠    劉桂華;劉紅河;

孔雀石綠脅迫下鯽肝臟和肌肉抗氧化酶的動(dòng)態(tài)變化    陳曉妮;吳志強(qiáng);

日本加強(qiáng)孔雀石綠檢測(cè)    劉國(guó)信

廣東活魚(yú)加強(qiáng)檢測(cè)“孔雀石綠”    記者 林曉麗 實(shí)習(xí)生 秦曉蓉

廣州6家機(jī)構(gòu)可檢測(cè)“孔雀石綠”    記者 葉平生

“孔雀石綠”事件的幾點(diǎn)疑問(wèn)    譚雄偉

“孔雀石綠”的貓膩在哪里？    曾進(jìn)

“孔雀石綠”不能一禁了之    顧兆農(nóng)

上海緊急抽檢孔雀石綠    本報(bào)記者 施嘉奇 本報(bào)駐京記者 劉棟

五問(wèn)孔雀石綠    本報(bào)記者 張靜波

浙海院制定孔雀石綠檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)    張博

警惕“孔雀石綠”襲擊水產(chǎn)品市場(chǎng)    記者 孫玲

孔雀石綠類(lèi)違禁獸藥檢測(cè)技術(shù)優(yōu)化研究及膳食暴露評(píng)估    李曉麗

二氧化氯和孔雀石綠對(duì)鯽魚(yú)的毒性作用研究    陳曉妮

烏龜孔雀石綠浸泡后的組織病理學(xué)研究及肝臟全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定    嚴(yán)福祥

孔雀石綠單克隆抗體的制備及其檢測(cè)試劑盒的初步研制    龔朋飛

水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物多殘留檢測(cè)的液相色譜—質(zhì)譜法研究    吳學(xué)立

孔雀石綠多克隆抗體的制備及其快速檢測(cè)方法的研究    馬小輝

基于金納米基底表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)快速檢測(cè)魚(yú)肉中孔雀石綠及隱性孔雀石綠的研究    張?jiān)磮@

呋喃西林、呋喃唑酮和孔雀石綠在雜交鱧（斑鱧♀×烏鱧♂）體內(nèi)殘留消除規(guī)律研究    劉書(shū)貴

孔雀石綠降解菌Arthrobacter sp.M6的分離、鑒定及其降解特性的研究    房桂華

魚(yú)體內(nèi)孔雀石綠殘留檢測(cè)方法及代謝的研究    邱緒建