甲烷蛋白的制備及核酸去除

【摘要】：甲烷氧化菌是可以利用甲烷作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌,是生產(chǎn)甲烷單細(xì)胞蛋白的主要菌體。甲烷作為制備甲烷單細(xì)胞蛋白(甲烷蛋白)的碳源,是碳的完全還原形式,沒(méi)有產(chǎn)生直接毒性的問(wèn)題,不含致癌的稠環(huán)芳烴等雜質(zhì),在發(fā)酵工藝過(guò)程中也不需要昂貴的提純?cè)O(shè)備,國(guó)內(nèi)對(duì)甲烷蛋白的研究仍處在試驗(yàn)階段。本論文主要研究了幾種生長(zhǎng)因素對(duì)甲基彎菌Methylosinus trichosporium IMV3011生長(zhǎng)的影響以及過(guò)量核酸的去除并確立一種簡(jiǎn)單有效的核酸去除方法。為利用甲烷氧化菌生產(chǎn)甲烷單細(xì)胞蛋白奠定基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容包括： 根據(jù)甲烷氧化菌利用碳源的特殊性對(duì)甲基彎菌IMV3011在間歇發(fā)酵中進(jìn)行開(kāi)放式培養(yǎng),并與封閉式環(huán)境下培養(yǎng)的IMV3011在菌體生長(zhǎng)曲線以及MMO酶活性方面進(jìn)行比較,驗(yàn)證了其在非滅菌的情況下也能正常生長(zhǎng)。 采用每日更換新鮮培養(yǎng)基的方法對(duì)IMV3011進(jìn)行半連續(xù)培養(yǎng),分析菌體生長(zhǎng)哪個(gè)階段更適于補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基,確定一種較優(yōu)的培養(yǎng)方式。驗(yàn)證得出培養(yǎng)IMV3011時(shí)可以在48h后進(jìn)行新鮮培養(yǎng)基的補(bǔ)料和添加,這樣有助于一些對(duì)其生長(zhǎng)起正向作用的代謝產(chǎn)物的積累,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。 不同外源因子對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響。分別考察了D-生物素、葉酸、核黃素、維生素B12等生長(zhǎng)因子對(duì)IMV3011生長(zhǎng)的影響,并對(duì)不同生長(zhǎng)因子的添加對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：未添加外源因子時(shí),菌體生長(zhǎng)延滯期為62.5h,發(fā)酵終止后干重為0.31gdwcL-1。D-生物素添加量為1Oug/L時(shí),延滯期縮短到5.8h,發(fā)酵終止后的干重為0.29gdwcL-1,與未添加時(shí)相比大大縮短了延滯期的時(shí)間但干重有所下降。葉酸添加量為5ug/L時(shí),延滯期最短,縮短到3.2h,發(fā)酵終止后的干重為0.97gdwcL-1是未添加時(shí)的3倍。核黃素添加量為5ug/L時(shí),延滯期縮短到15.1h,發(fā)酵終止后的干重為0.77gdwcL-1,是未添加時(shí)的2.5倍。維生素B12添加量為0.5ug/L時(shí),延滯期為18.7h,發(fā)酵終止后的干重為0.84gdwcL-1,是未添加時(shí)的2.7倍。 研究了超聲波法、濃鹽法、濃鹽與超聲波破碎結(jié)合法、菌體自溶法等四種處理方法對(duì)菌體中核酸的脫除效果。通過(guò)比較得出菌體自溶法是去核酸的最優(yōu)方法。研究了溫度、菌體濃度、處理時(shí)間、體系pH值等四種因素對(duì)菌體自溶法脫除核酸效果的影響。通過(guò)菌體自溶法的單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),確定了最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案,得出IMV3011中過(guò)量核酸的脫除的最佳條件為：溫度70℃,菌體濃度0.9%(濕重),處理時(shí)間50min,體系pH值10。在此最佳條件下核酸脫除量最大值為44.75ug/mL,以菌體內(nèi)核酸含量占菌體干重的9.9%計(jì)算,脫除率為50.2%。 【關(guān)鍵詞】：甲烷氧化菌 單細(xì)胞蛋白 發(fā)酵方式 去核酸
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：TQ936
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 1 緒論11-20
• 1.1 單細(xì)胞蛋白11-12
• 1.1.1 單細(xì)胞蛋白的概念11
• 1.1.2 單細(xì)胞蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值11-12
• 1.1.3 生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的菌種選擇12
• 1.1.4 生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的原料12
• 1.2 甲烷氧化菌12-14
• 1.2.1 甲烷氧化菌的概念及分類12-13
• 1.2.2 甲烷氧化菌的碳代謝途徑13-14
• 1.2.3 甲烷單加氧酶14
• 1.3 甲烷氧化菌單細(xì)胞蛋白14-18
• 1.3.1 特點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值14-16
• 1.3.2 甲烷氧化菌制備單細(xì)胞蛋白的研究狀況16-18
• 1.4 工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵方式18
• 1.5 本課題來(lái)源及研究意義18-19
• 1.5.1 課題來(lái)源18
• 1.5.2 研究意義18-19
• 1.6 論文的研究?jī)?nèi)容19-20
• 2 甲烷氧化菌的開(kāi)放培養(yǎng)20-29
• 2.1 引言20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料20-22
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)菌種21-22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 2.3.1 甲烷氧化菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制22
• 2.3.2 甲烷氧化菌的培養(yǎng)22-23
• 2.3.3 甲烷氧化菌單加氧酶酶活測(cè)定23
• 2.3.4 生物量測(cè)定及數(shù)據(jù)分析23-24
• 2.4 結(jié)果與分析24-28
• 2.4.1 環(huán)氧丙烷標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立24-25
• 2.4.2 復(fù)壯前后的對(duì)比25-26
• 2.4.3 兩種培養(yǎng)方式對(duì)IMV3011生長(zhǎng)的影響26-28
• 2.5 本章小結(jié)28-29
• 3 兩種發(fā)酵方式對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響29-37
• 3.1 引言29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料29-31
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器29-30
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料30
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)菌種30-31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法31-32
• 3.3.1 甲烷氧化菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制31
• 3.3.2 甲烷氧化菌的培養(yǎng)31
• 3.3.3 甲烷氧化菌單加氧酶酶活的測(cè)定31
• 3.3.4 生物量測(cè)定及數(shù)據(jù)分析31-32
• 3.4 結(jié)果與分析32-36
• 3.4.1 Ⅰ組中兩種培養(yǎng)方式對(duì)IMV3011生長(zhǎng)的影響32-34
• 3.4.2 Ⅱ組中兩種培養(yǎng)方式對(duì)IMV3011生長(zhǎng)的影響34-36
• 3.5 本章小結(jié)36-37
• 4 生長(zhǎng)因子對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響37-49
• 4.1 引言37
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器與器材37-38
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器37-38
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料38
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)菌種38
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法38-39
• 4.3.1 甲烷氧化菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制38
• 4.3.2 甲烷氧化菌的培養(yǎng)38-39
• 4.3.3 確定生長(zhǎng)因子最適添加量39
• 4.3.4 生長(zhǎng)因子對(duì)菌體生長(zhǎng)狀況的影響39
• 4.3.5 生物量測(cè)定及數(shù)據(jù)分析39
• 4.4 結(jié)果與分析39-48
• 4.4.1 生長(zhǎng)因子最適添加量的確定39-44
• 4.4.2 生長(zhǎng)因子對(duì)菌體生長(zhǎng)狀況的影響44-48
• 4.5 本章小結(jié)48-49
• 5 甲烷氧化菌中過(guò)量核酸的去除49-61
• 5.1 引言49
• 5.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料49-51
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器49-50
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)菌種51
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 5.3.1 甲烷氧化菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制51
• 5.3.2 甲醇為碳源的菌種培養(yǎng)51
• 5.3.3 核酸脫除方法的比較51-53
• 5.3.4 菌體自溶法單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)53
• 5.3.5 菌體自溶法正交實(shí)驗(yàn)53-54
• 5.3.6 確定最優(yōu)核酸脫除方法54
• 5.3.7 核酸脫除量的測(cè)定方法54-55
• 5.4 結(jié)果與分析55-60
• 5.4.1 濃鹽法、超聲波破碎法、菌體自溶法及濃鹽和超聲波破碎結(jié)合法的比較55-56
• 5.4.2 菌體自溶法單因素試驗(yàn)56-59
• 5.4.3 菌體自溶法最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案的確定59-60
• 5.5 本章小結(jié)60-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 附錄166-68
• 附錄268-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文69-70
• 致謝70

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