活性污泥中甲烷菌的研究

【摘要】：一、探討污泥干化蘆葦床穩(wěn)定化污泥中甲烷氧化菌多樣性,利用PCR-DGGE技術(shù)分析不同時(shí)期、不同干化床污泥中甲烷氧化菌群落變化。通過對(duì)DGGE圖譜的聚類分析了不同樣品的相似度。計(jì)算1單元到3單元蘆葦床污泥樣品隨著不同月份變化得出的香農(nóng)-威納(Shano-Wiener)指數(shù)分別為2.03、1.09、1.87,2.04、1.36、1.95,1.59、1.17、1.92,均勻指數(shù)分別為0.99、0.97、0.95,0.97、0.98、0.99,0.95、0.97、0.99,即隨著不同月份的改變,1單元干化床的均勻指數(shù)均下降,2、3單元干化床的均勻指數(shù)均上升。利用測(cè)序后得到的序列進(jìn)行親緣性比對(duì),并結(jié)合優(yōu)勢(shì)種屬的變化分析污泥樣品甲烷氧化菌群落的演替。結(jié)果表明,污泥干化蘆葦床污泥樣品中甲烷氧化菌的多樣性,可以通過PCR-DGGE分析。同一時(shí)期不同干化床污泥中甲烷氧化菌群落相似度較高；而同一干化床、不同時(shí)期污泥中的甲烷氧化菌群落有一定的差異。污泥干化蘆葦床中優(yōu)勢(shì)種屬主要隨蘆葦生長(zhǎng)時(shí)期和污泥穩(wěn)定化時(shí)間的延長(zhǎng)而改變?；谛蛄泻拖到y(tǒng)發(fā)育樹分析,干化床污泥樣品中主要的優(yōu)勢(shì)菌屬是未培養(yǎng)的Ⅰ型甲烷氧化菌,表明有通氣結(jié)構(gòu)的蘆葦床更能有效氧化甲烷,有利于減少甲烷的排放。二、從2單元污泥干化蘆葦床樣品中分離篩選出Ⅱ型甲烷氧化菌。利用涂平板,進(jìn)行稀釋分離。本菌株的分類,可以根據(jù)不同相的分類方法。結(jié)果表明,菌株W5在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,粉紅色,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育、形態(tài)特征、等分析表明菌株W5屬于甲基桿菌屬(Methylobacter)。三、利用厭氧技術(shù)從3單元污泥干化床中分離出一株產(chǎn)甲烷菌株C5,在熒光顯微鏡下觀察該菌落有藍(lán)綠色熒光。通過對(duì)C5菌株的16S rDNA進(jìn)化地位分析,它與甲烷八疊球菌屬的相似性最大99%,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析以及形態(tài)學(xué)分析此菌株為甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)。 【關(guān)鍵詞】：污泥干化蘆葦床 甲烷氧化菌 產(chǎn)甲烷菌 16s rDNA DGGE 多樣性
【學(xué)位授予單位】：大連工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X703;X172
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 緒論10-19
• 1.1 研究背景10
• 1.2 甲烷菌的簡(jiǎn)介10-16
• 1.2.1 產(chǎn)甲烷菌11-13
• 1.2.1.1 產(chǎn)甲烷菌研究進(jìn)展和生長(zhǎng)環(huán)境11-12
• 1.2.1.2 產(chǎn)甲烷菌的分類和多樣性和生理12-13
• 1.2.1.3 產(chǎn)甲烷菌合成甲烷途徑13
• 1.2.2 甲烷氧化菌13-16
• 1.2.2.1 甲烷氧化菌特征酶14-16
• 1.2.2.2 甲烷氧化菌的形態(tài)與分類16
• 1.2.2.3 甲烷氧化的途徑16
• 1.3 產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的潛在應(yīng)用價(jià)值16
• 1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)16-17
• 1.5 降落PCR17
• 1.6 本課題研究工作17-19
• 1.6.1 本課題研究?jī)?nèi)容17-18
• 1.6.2 本課題研究意義18-19
• 第二章 基于PMOA基因分析污泥干化蘆葦床中甲烷氧化菌的多樣性19-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 樣品采集19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑19-20
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.1.4 溶液配制21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 2.2.1 樣品DNA提取21-22
• 2.2.2 樣品DNA純化22
• 2.2.3 PMOA基因PCR擴(kuò)增22
• 2.2.4 PCR-DGGE條件22
• 2.2.5 切膠和測(cè)序22-23
• 2.2.6 DGGE圖譜分析和數(shù)據(jù)處理23
• 2.2.7 DGGE圖譜聚類分析23
• 2.2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建23
• 2.3 結(jié)果與討論23-29
• 2.3.1 總DNA的提取23-24
• 2.3.2 基于PMOA基因PCR擴(kuò)增24-25
• 2.3.3 引物帶有GC-夾進(jìn)行PCR擴(kuò)增25-26
• 2.3.4 D GGE圖譜分析26-28
• 2.3.5 多樣性指數(shù)分析28
• 2.3.6 DGGE圖譜聚類分析28-29
• 2.4 本章小結(jié)29-30
• 第三章 污泥干化蘆葦床中甲烷氧化菌的分離與鑒定30-38
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 3.1.1 污泥樣品采集30
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑30-31
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 3.2.1 培養(yǎng)基配制31
• 3.2.2 甲烷氧化菌的篩選31-32
• 3.2.2.1 污泥樣品的預(yù)處理31
• 3.2.2.2 甲烷氧化菌的分離與純化31-32
• 3.2.3 菌株的形態(tài)觀察32
• 3.2.4 甲烷氣體分析方法32
• 3.2.5 16SRDNA分析和構(gòu)建發(fā)育樹32-33
• 3.2.5.1 菌體DNA提取32
• 3.2.5.2 16SRDNA PCR擴(kuò)增32-33
• 3.2.5.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹33
• 3.3 結(jié)果與討論33-37
• 3.3.1 菌體形態(tài)33-34
• 3.3.2 甲烷濃度34
• 3.3.3 菌體的DNA34
• 3.3.4 16SRDNA PCR擴(kuò)增34-35
• 3.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建35-37
• 3.4 本章小結(jié)37-38
• 第四章 產(chǎn)甲烷菌的分離與鑒定38-46
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 4.1.1 污泥樣品采集38
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑38
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器38-39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法39-42
• 4.2.1 培養(yǎng)基配制39
• 4.2.2 產(chǎn)甲烷菌的篩選39-40
• 4.2.2.1 污泥樣品的預(yù)處理39
• 4.2.2.2 產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)39-40
• 4.2.2.3 產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)40
• 4.2.2.4 形態(tài)觀察和倒置熒光顯微鏡觀察40
• 4.2.2.5 擴(kuò)大培養(yǎng)40
• 4.2.3 菌體DNA的提取40-41
• 4.2.4 16SRDNA PCR擴(kuò)增41-42
• 4.2.5 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹42
• 4.3 結(jié)果與討論42-45
• 4.3.1 產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)42
• 4.3.2 倒置熒光顯微鏡觀察42-43
• 4.3.3 16SRDNA PCR擴(kuò)增43-44
• 4.3.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹44-45
• 4.4 本章小結(jié)45-46
• 第五章 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 致謝50

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