淡水環(huán)境中新型酯酶和甲烷氧化菌的篩選與鑒定

【摘要】： 本論文的研究工作涉及環(huán)境微生物學的兩個不同領域,第一部分是長江淡水微生物宏基因組文庫的構建以及新型脂肪酶的篩選;第二部分是稻田淡水中新型甲烷氧化菌株的分離。 1、長江淡水文庫中新型脂肪酶的篩選 盡管微生物非肉眼可見,但其是地球生物群落的一個重要的組成部分。在自然環(huán)境下,微生物進行獨特的卻不可缺少的生物轉化,產(chǎn)生對地球生命活動非常重要的生物物質(zhì),并展現(xiàn)出了地球生命的多樣性。其是地球上已知種類最多、數(shù)量最大、分布最廣的生物類群,據(jù)估計僅原核生物數(shù)量達4×10~(30)-6×10~(30)。 微生物可以產(chǎn)生兩種不同的水解脂肪的酶,分別為酯酶(esterase)(EC 3.1.1.1)和“真正的”脂肪酶(lipase)(EC 3.1.1.3)。兩者都可以將甘油三酯分解成脂肪酸和甘油以及進行其逆反應。微生物脂肪酶資源豐富,具有在有機溶劑中穩(wěn)定性好、廣泛的底物特異性、高度的位置選擇性和異構體選擇性、催化活性高而副反應少等特點,因此被廣泛應用于食品加工、新型生物材料、生物傳感器等領域。 但是由于目前環(huán)境中有99%的微生物都是不可(難)培養(yǎng)的,只有不到1%的微生物能夠被人類認識并利用,所以近年來發(fā)展起來的宏基因組學就是利用分子生物學技術繞過培養(yǎng)分離方法來對微生物的多樣性及其功能進行研究。目前已經(jīng)通過此技術篩選到大量新的功能基因,例如編碼脂肪酶、蛋白酶、腈水解酶、氧化還原酶和淀粉酶等活性物質(zhì)的基因。長江作為我國主要的淡水資源,蘊含著極其豐富的微生物資源,必然包含著極其多樣的活性物質(zhì)。 本工作是結合了原位裂解微生物獲取大片段DNA的方法對安慶長江水段(30°30'11.30 N,117°04'07.70 E)中的微生物資源進行挖掘,構建了宏基因組文庫并對該環(huán)境中的脂肪酶基因資源進行篩選,得到了一種新型的脂肪酶。EstY含有423個氨基酸,其分子量為44kDa,等電點為7.28。EstY能水解對硝基苯乙酸(C2),對硝基苯丁酸(C4),對硝基苯辛酸(C8),對硝基苯癸酸(C10),對硝基苯月桂酸(C12),對硝基苯豆蔻酸(C14)和對硝基苯棕櫚酸(C16)多種對硝基苯脂。其酶活的最適pH為9.0,最適溫度為50℃。Mn~(2+)、Co~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)強烈的抑制EstY的活性,但EstY卻對Mg~(2+)表現(xiàn)出一定的依賴性。此外,EstY在10%濃度的乙醇,丙酮,異丙醇和二甲基亞砜的溶劑里不喪失活性。根據(jù)序列保守性和進化樹分析,可以初步推斷EstY和其相關的七個脂肪酶不屬于任何一個已經(jīng)的細菌脂肪酶家族。 2、稻田淡水中新型甲烷氧化菌株的分離 近年來,溫室效應導致的環(huán)境問題近年來愈演愈烈,全球氣候變暖的趨勢日益明顯,一些突出的環(huán)境問題如病蟲害增加、海平面上升、氣候冷暖反常、海洋風暴增多、土地干旱、沙漠化等無不與之密切相關。溫室氣體增多是造成溫室效應的主要原因。通常所知,二氧化碳是主要的溫室氣體,對溫室效應的貢獻占到了60%以上。不容忽視的是,甲烷同樣也是一種重要的溫室氣體,但以單位分子數(shù)而言,甲烷的溫室效應要比二氧化碳大上25倍。從這一點上說,降低大氣中甲烷的含量比降低二氧化碳對溫室效應的防治更為有效。 甲烷氧化細菌是甲基氧化細菌的一個分支,其獨特之處在于其能利用甲烷作為唯一的碳源和能源。幾乎所有的甲烷氧化菌都是專性好氧甲烷氧化菌,甲烷氧化菌氧化甲烷最終生成二氧化碳,并在此過程中獲得生長所需的能量。甲烷氧化菌的典型特征是含有甲烷單加氧酶,可催化甲烷氧化為甲醇,甲醇進一步氧化為甲醛,甲醛再同化為細胞生物量或通過甲酸氧化為二氧化碳重新回到大氣的碳庫中,即甲烷→甲醇→甲醛→甲酸鹽→二氧化碳。甲烷氧化菌于1906年被首次分離,1970年Whittenbury等分離和鑒定了100多種能利用甲烷的細菌,奠定了現(xiàn)代甲烷氧化菌分類的基礎。 本課題從合肥郊區(qū)(31°52'N,117°17'W)水稻田中分離了一株革蘭氏陽性,短桿狀,不運動,沒有孢子形成的甲烷氧化菌。此菌為專性好氧菌,生長最適溫度為30℃,最適pH為pH7.0-8.0,只能在以甲烷為碳源的培養(yǎng)基中生長。根據(jù)16SrRNA和pmoA序列比對,發(fā)現(xiàn)此菌屬于typeⅡ(α-proteobacteria)甲烷氧化菌的其和一些甲基孢囊菌屬(Methylocystis)的未鑒定的菌株有非常高的相似度,但不屬于已發(fā)現(xiàn)的五個甲基孢囊菌屬的任何一個種。因此,我們初步推斷此菌為甲基孢囊菌屬的一個新種(=CGMCC 1.5062=ATCC BAA-1775)。 【關鍵詞】：淡水宏基因組 酯酶 脂肪酶家族 甲烷氧化菌 進化樹
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：Q93
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第1章 緒論(環(huán)境宏基因組與甲烷氧化菌研究進展)15-56
• 1.1 引言15-16
• 第一部分 環(huán)境宏基因組與脂肪酶的篩選16-31
• 1.2 環(huán)境宏基因組研究技術進展16-30
• 1.2.1 環(huán)境宏基因組研究概況16-17
• 1.2.2 環(huán)境宏基因組的構建17-18
• 1.2.2.1 環(huán)境樣品總DNA的提取17-18
• 1.2.2.2 載體的選擇18
• 1.2.2.3 宿主的選擇18
• 1.2.3 環(huán)境宏基因組文庫的篩選18-23
• 1.2.3.1 文庫篩選的可行性分析18-19
• 1.2.3.2 篩選文庫的的方法19-21
• 1.2.2.3 各種環(huán)境宏基因組文庫的篩選21-23
• 1.2.4 從環(huán)境宏基因組文庫中篩選脂肪酶23-30
• 1.2.4.1 細菌脂肪酶簡介23
• 1.2.4.2 細菌脂肪酶的研究概況23-24
• 1.2.4.3 細菌脂肪酶家族24-28
• 1.2.4.4 脂肪酶的用途28-29
• 1.2.4.5 環(huán)境中篩選脂肪酶29-30
• 1.3 本研究的目的和意義30-31
• 1.3.1 本研究的目的30
• 1.3.2 本研究的意義30-31
• 第二部分 新型甲烷氧化菌的篩選31-45
• 1.4 甲烷氧化菌研究進展31-43
• 1.4.1 甲烷氧化菌研究背景31-34
• 1.4.1.1 地球上甲烷的來源和消耗方式31-32
• 1.4.1.2 微生物介導的甲烷循環(huán)32-33
• 1.4.1.3 甲烷氧化菌概況33-34
• 1.4.1.4 甲烷氧化菌的研究進展34
• 1.4.2 甲烷氧化菌的分類34-35
• 1.4.3 甲烷氧化菌的生態(tài)分布35-36
• 1.4.4 甲烷氧化菌的特征酶36-39
• 1.4.5 甲烷氧化菌的研究方法39-43
• 1.4.5.1 以16S rRNA為基礎的甲烷氧化菌的生態(tài)學研究39-40
• 1.4.5.2 功能性基因探針檢測甲烷氧化菌40-41
• 1.4.5.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)和反轉錄PER方法分析41-42
• 1.4.5.4 磷脂酸和同位素標記技術42-43
• 1.5 本研究的目的和意義43-45
• 1.5.1 本研究的目的43-44
• 1.5.2 本研究的意義44-45
• 參考文獻45-56
• 第2章 長江淡水宏基因組文庫中新型酯酶的篩選與鑒定56-83
• 2.1 引言56-57
• 第一部分 材料和方法57-70
• 2.2 試驗基本材料57-58
• 2.2.1 淡水樣品來源57
• 2.2.2 試驗所用基本材料和儀器設備57-58
• 2.3 長江水微生物宏基因組庫的建立58-60
• 2.3.1 長江淡水表層微生物的提取58
• 2.3.2 長江淡水宏基因組文庫的建立58-60
• 2.3.2.1 長江水微生物基因組的提取58-59
• 2.3.2.2 酶切并回收大片段DN A59-60
• 2.3.2.3 構建BAC基因組文庫60
• 2.4 新型酯酶的篩選與鑒定60-70
• 2.4.1 篩選帶有脂肪酶基因的陽性克隆60
• 2.4.2 對陽性克隆進行亞克隆并測序分析60-70
• 2.4.2.1 菌種保存和擴大培養(yǎng)60-61
• 2.4.2.2 抽出陽性克隆中帶有脂肪酶基因的質(zhì)粒61
• 2.4.2.3 亞克隆以及測序分析61-62
• 2.4.2.4 分析測序結果62-63
• 2.4.2.5 構建EstY蛋白表達質(zhì)粒63-65
• 2.4.2.6 EstY蛋白的表達與純化65-67
• 2.4.2.7 EstY的酶活測試67-70
• 第二部分 結果與討論70-82
• 2.5 宏基因組文庫的構建70-73
• 2.5.1 長江水微生物大片段基因組的提取70
• 2.5.2 宏基因組文庫的構建70-72
• 2.5.2.1 酶切并回收大片段DNA70
• 2.5.2.2 構建BAC基因組文庫70-72
• 2.5.3 結果討論72-73
• 2.6 新型酯酶的篩選與鑒定73-82
• 2.6.1 篩選帶有脂肪酶基因的陽性克隆73
• 2.6.2 對陽性克隆進行亞克隆并測序分析73-76
• 2.6.2.1 亞克隆庫的建立74
• 2.6.2.2 亞克隆庫的篩選74
• 2.6.2.3 陽性亞克隆的序列分析74-76
• 2.6.3 酯酶基因EstY融合蛋白的表達和純化76-77
• 2.6.4 EstY的酶活測試77-80
• 2.6.4.1 不同底物的酶活測定77-78
• 2.6.4.2 不同pH對酶活力的影響測定78
• 2.6.4.3 不同溫度對酶活力的影響測定78
• 2.6.4.4 不同離子對酶活力的影響測定78
• 2.6.4.5 不同的有機溶劑及去污劑對酶活力的影響測定78
• 2.6.4.6 計算EstY的米氏常數(shù)78-80
• 2.6.5 結果討論80-82
• 參考文獻82-83
• 第3章 新型甲烷氧化菌的分離及特性研究83-111
• 3.1 引言83-84
• 第一部分 材料和方法84-100
• 3.2 實驗配料84-88
• 3.2.1 試驗儀器設備84
• 3.2.2 甲基氧化菌培養(yǎng)基及其它培養(yǎng)基組分84-87
• 3:2.3 其它試劑87-88
• 3.2.4 試驗所用引物88
• 3.3 新型甲烷氧化菌的篩選與鑒定88-92
• 3.3.1 取樣地點88
• 3.3.2 新型甲烷氧化菌的篩選88-89
• 3.3.3 新型甲烷氧化菌的鑒定89-92
• 3.3.3.1 新型甲烷氧化菌的基因組提取89-90
• 3.3.3.2 對新型甲烷氧化菌16S rRNA序列特異性擴增和測序90-92
• 3.3.3.3 16S rRNA的序列分析92
• 3.3.3.4 新型甲烷氧化菌的形態(tài)特征觀察92
• 3.3.3.5 菌種保藏92
• 3.4 新型甲烷氧化菌的生理生化遺傳學特性研究92-100
• 3.4.1 革蘭氏染色法92-93
• 3.4.2 甲烷氧化細菌生長曲線及甲烷降解曲線的測定93
• 3.4.3 甲烷氧化菌溫度梯度生長測定93
• 3.4.4 甲烷氧化菌pH梯度生長測定93
• 3.4.5 甲烷氧化細菌NaCl梯度實驗方法93-94
• 3.4.6 唯一碳源試驗94
• 3.4.7 唯一氮源試驗94
• 3.4.8 過氧化氫試驗94
• 3.4.9 脲酶測定試驗94
• 3.4.10 甲烷氧化細菌特征酶基因pmoA,mxaF和mmoX的鑒定94-97
• 3.4.10.1 pmoA,mxaF和mmoX片段的擴增和測序94-97
• 3.4.10.2 pmoA基因片段的序列分析97
• 3.4.11 甲烷氧化菌的固氮酶基因nifH的鑒定97-100
• 3.4.11.1 固氮酶基因nifH片段的擴增與測序97-99
• 3.4.11.2 固氮酶基因nifH片段的鑒定99-100
• 第二部分 結果與討論100-109
• 3.5 新型甲烷氧化菌的篩選與鑒定100-109
• 3.5.1 篩選結果100
• 3.5.2 甲烷氧化菌M261的形態(tài)特征100
• 3.5.3 甲烷氧化菌M261的鑒定結果與分析100-104
• 3.5.4 甲烷氧化菌M261的生理試驗結果104-106
• 3.5.4.1 細菌革蘭氏染色結果分析104
• 3.5.4.2 甲烷氧化細菌生長曲線及甲烷降解曲線104
• 3.5.4.3 甲烷氧化菌pH梯度生長結果104-105
• 3.5.4.4 甲烷氧化菌溫度梯度生長測定105
• 3.5.4.5 甲烷氧化細菌NaCl梯度生長結果105
• 3.5.4.6 唯一碳源試驗105
• 3.5.4.7 唯一氮源試驗105
• 3.5.4.8 脲酶測定試驗105
• 3.5.4.9 過氧化氫酶試驗105-106
• 3.5.5 甲烷氧化菌M261的特征基因分析106-108
• 3.5.5.1 甲烷氧化細菌特征酶基因pmoA和mmoX的鑒定106
• 3.5.5.2 甲烷氧化菌的固氮酶基因nifH的鑒定106
• 3.5.5.3 甲烷氧化菌pmoA的系統(tǒng)發(fā)生樹分析106-108
• 3.5.6 結果討論108-109
• 參考文獻109-111
• 致謝111-112
• 在讀期間發(fā)表的學術論文112

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