甲烷氧化混合菌群的富集培養(yǎng)及其治理瓦斯工藝研究

【摘要】：甲烷氧化菌能在溫和條件下特異的利用甲烷,具有應用于甲烷減排和煤礦瓦斯治理的潛力。本論文在對我國典型煤礦土壤的甲烷氧化菌進行分子生態(tài)學分析的基礎上,確定甲烷氧化混合菌的富集培養(yǎng)策略,獲得高效利用甲烷的穩(wěn)定混合菌群,對其特性和功能進行研究,實現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng),并在實驗室和煤礦現(xiàn)場進行了瓦斯治理實驗。 用多種分子生態(tài)學方法解析了瓦斯煤礦土壤中的甲烷氧化菌及相關微生物的組成信息。該樣品含有大量的甲烷氧化菌及甲基氧化菌,其中甲烷氧化菌以Ⅰ型為主,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型甲烷氧化菌的含量分別為78.6%、7.1%和14.3%。 分別以甲烷氣和人工瓦斯氣作為唯一碳源對土壤樣品進行好氧選擇性傳代培養(yǎng)。富集過程中甲烷和乙烷的消耗能力得到顯著強化,總細菌的多樣性逐漸減少,Ⅰ型甲烷氧化菌則得到富集,20代以后菌群結構和甲烷去除能力趨于穩(wěn)定。 研究了兩種氣體條件富集的混合菌群的特性,包括菌體形態(tài)、生長特性、代謝特性和微生物群落結構。馴化后Ⅱ型甲烷氧化菌數(shù)量增加,人工瓦斯氣富集的混合菌菌群更豐富。混合菌比純菌的甲烷消耗能力更強,且無代謝產(chǎn)物積累。菌群間的協(xié)同作用能有效避免產(chǎn)物抑制,有利于菌群結構和功能的穩(wěn)定。 對兩種條件得到的混合菌的功能進行了系統(tǒng)分析。其在甲烷濃度為3~50%時都有較好的去除效果,最高可達241 ml CH4 h~(-1) OD660~(-1) (L culture)~(-1)。在20~42oC都能有效的去除甲烷。對H_2S、CO和SO_2等毒性氣體有很強的耐受性?；旌暇２乜捎?oC充甲烷密封保存法、-80oC凍存菌體法和-80oC添加石蠟油凍存法。 以甲烷氣富集的混合菌為對象,研究了甲烷氧化混合菌的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。成功開展了5L-300L和5L-600L的放大發(fā)酵實驗。混合菌在放大培養(yǎng)時,生長速度穩(wěn)定,且隨著發(fā)酵逐級放大,消耗甲烷能力以及菌群結構都能夠保持穩(wěn)定。 在實驗室模擬煤層、生物過濾實驗中研究混合菌去除甲烷的能力,并在河南三個礦井進行現(xiàn)場中試,將制備的菌液注入煤層并達飽和,甲烷去除效果顯著,說明富集的甲烷氧化混合菌有在煤礦中治理瓦斯的應用潛力。 【關鍵詞】：甲烷氧化菌 甲烷單加氧酶 分子生態(tài)學 發(fā)酵培養(yǎng) 煤礦瓦斯治理
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：X172
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-13
• 第1章 文獻綜述13-39
• 1.1 課題背景13-14
• 1.2 甲烷氧化菌及甲烷單加氧酶14-24
• 1.2.1 甲烷氧化菌的分類及特性16-20
• 1.2.2 甲烷單加氧酶的基因與蛋白20-22
• 1.2.3 甲烷單加氧酶的催化特性22-24
• 1.3 甲烷氧化菌的應用研究熱點24-31
• 1.3.1 甲烷氧化菌的培養(yǎng)工藝研究25-27
• 1.3.2 甲烷氧化菌的工業(yè)生物催化研究27-28
• 1.3.3 甲烷氧化菌的生物修復研究28-29
• 1.3.4 甲烷氧化菌及甲烷單加氧酶的基因工程研究29-30
• 1.3.5 甲烷氧化菌的分子生態(tài)學研究30-31
• 1.4 甲烷氧化菌在工業(yè)應用中存在的問題31-33
• 1.5 應用甲烷氧化菌治理煤礦瓦斯33-36
• 1.5.1 甲烷氧化菌在溫室氣體減排中的應用33-34
• 1.5.2 煤礦瓦斯治理現(xiàn)狀及生物治理的可行性34-36
• 1.6 論文的主要研究內(nèi)容36-39
• 1.6.1 研究內(nèi)容36-37
• 1.6.2 研究框架37-39
• 第2章 從煤礦土壤富集培養(yǎng)甲烷氧化混合菌39-64
• 2.1 引言39-40
• 2.2 實驗材料與方法40-45
• 2.2.1 DNA 提取和純化40
• 2.2.2 PCR 擴增16S rRNA 和功能基因40-41
• 2.2.3 核酸限制性片段長度多態(tài)性分析41
• 2.2.4 變性梯度凝膠電泳41-42
• 2.2.5 DNA 序列分析42
• 2.2.6 培養(yǎng)基及富集條件42-43
• 2.2.7 甲烷、乙烷的檢測方法43-45
• 2.3 煤礦土壤的特性分析45-47
• 2.4 煤礦土壤中甲烷氧化菌群落的功能基因解析47-54
• 2.4.1 基于功能基因pmoA 的 RFLP 分析47-50
• 2.4.2 基于功能基因mmoX 的RFLP 分析50-51
• 2.4.3 基于功能基因mxaF 的RFLP 分析51-54
• 2.5 不同條件從煤礦土壤富集甲烷氧化混合菌54-63
• 2.5.1 對甲烷和乙烷的消耗能力的變化55-57
• 2.5.2 富集過程的細菌群落變化57-59
• 2.5.3 富集過程的I型甲烷氧化菌群落變化59-61
• 2.5.4 富集過程的II型甲烷氧化菌群落變化61-63
• 2.6 本章小結63-64
• 第3章 甲烷氧化混合菌的特性分析64-90
• 3.1 引言64-65
• 3.2 實驗材料與方法65-67
• 3.2.1 菌種及培養(yǎng)方法65
• 3.2.2 顯微鏡和掃描電鏡觀察65
• 3.2.3 MMO 酶活測定65-66
• 3.2.4 代謝分析66-67
• 3.3 甲烷氧化混合菌的微生物群落分析67-81
• 3.3.1 基于16S rRNA 的RFLP 分析67-72
• 3.3.2 基于功能基因pmoA 的 RFLP 分析72-75
• 3.3.3 基于功能基因mmoX 的RFLP 分析75-77
• 3.3.4 基于功能基因mxaF 的RFLP 分析77-81
• 3.4 甲烷氧化混合菌的生長特性研究81-86
• 3.4.1 菌體形態(tài)81-83
• 3.4.2 生長狀況與干重曲線83-85
• 3.4.3 甲烷消耗與MMO 酶活85-86
• 3.5 甲烷氧化混合菌的代謝分析86-87
• 3.6 甲烷氧化混合菌的協(xié)同作用機理87-88
• 3.7 本章小結88-90
• 第4章 甲烷氧化混合菌的功能分析和保藏90-103
• 4.1 引言90-91
• 4.2 實驗材料與方法91
• 4.2.1 評價方法91
• 4.2.2 保藏方法91
• 4.3 對不同濃度甲烷的消耗能力91-93
• 4.4 不同溫度下對甲烷的消耗能力93-95
• 4.5 對毒性氣體的耐受性95-97
• 4.6 對煤礦瓦斯中甲烷的去除能力97-98
• 4.7 甲烷氧化混合菌的保藏方法研究98-101
• 4.8 本章小結101-103
• 第5章 甲烷氧化混合菌的大規(guī)模發(fā)酵研究103-120
• 5.1 引言103-104
• 5.2 實驗方法與裝置104-108
• 5.2.1 種子培養(yǎng)104
• 5.2.2 5L 發(fā)酵罐培養(yǎng)104-105
• 5.2.3 40L-300L 二聯(lián)發(fā)酵罐105-107
• 5.2.4 100L-600L 二聯(lián)發(fā)酵罐107-108
• 5.3 混合菌在5L 發(fā)酵罐的培養(yǎng)研究108-112
• 5.3.1 生長特性108-110
• 5.3.2 甲烷去除能力110-111
• 5.3.3 菌群變化111-112
• 5.4 混合菌放大發(fā)酵研究112-119
• 5.4.1 5L-40L-300L 放大發(fā)酵112-113
• 5.4.2 5L-100L-600L 放大發(fā)酵113-119
• 5.5 本章小結119-120
• 第6章 甲烷氧化混合菌治理煤礦瓦斯應用研究120-130
• 6.1 引言120-121
• 6.2 在實驗室模擬煤層中去除甲烷121-122
• 6.3 應用生物濾器去除甲烷122-124
• 6.4 河南煤礦掘進煤層注入試驗124-127
• 6.4.1 禹州市軍陽礦業(yè)礦井中試124-126
• 6.4.2 禹州市神火集團礦井中試126-127
• 6.4.3 河南永錦能源有限公司礦井中試127
• 6.5 甲烷氧化混合菌治理瓦斯的前景分析127-129
• 6.6 本章小結129-130
• 結論130-134
• 參考文獻134-149
• 致謝149-150
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果150-151

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