厭氧甲烷氧化微生物代謝分子機制及其潛在參與礦物形成機理的研究

【摘要】：微生物主導的厭氧甲烷氧化作用(AOM,anaerobic oxidation of methane)對全球氣候、海洋地質地貌以及生態(tài)系統(tǒng)具有重要的影響。每年有4×108噸甲烷通過AOM消耗,相當于全球海洋甲烷年產量的85%,這是海洋碳循環(huán)中的重要組成,因此AOM直接影響著全球的氣候變化;AOM會促進環(huán)境中碳酸鹽礦物的形成,參與海底地質地貌的改變;AOM還能夠將甲烷轉變成其它異養(yǎng)生物能利用的有機質,為生態(tài)系統(tǒng)提供碳源和能量。在當今全球氣候變暖的背景下研究參與和影響甲烷生物地球化學循環(huán)的分子機制和環(huán)境調控因子,將為合理開發(fā)、利用環(huán)境資源和保護地球生態(tài)環(huán)境提供科學基礎和理論依據(jù)。厭氧甲烷氧化古菌(ANME-1、-2、-3)是目前已知的進行AOM的微生物類群,在環(huán)境中它們通常和硫酸鹽還原菌(SRB)或其它細菌形成2-20微米的細胞團,由于ANME和細胞團中其他的細菌都不能在實驗室環(huán)境下進行純培養(yǎng),人們無法采用傳統(tǒng)的微生物學研究方法研究此類微生物。在本研究開展之前,應用宏基因組手段獲得的ANME基因組覆蓋率只有20%左右,SRB和細胞團中其它微生物的基因組信息則更少。這極大地限制了人們對細胞團中不同微生物代謝功能以及微生物之間的相互關系的理解和認識。在本研究的前期工作中我們獲得了一個甲烷厭氧氧化和硫酸鹽還原活性很高的富集培養(yǎng)物,其主要的微生物組成是ANME-2a和SRB。在此基礎上我們創(chuàng)新性地將單細胞顯微操作分選、全基因組擴增以及高通量測序手段應用于富集物中ANME形成的單個細胞團。經過大量的分選我們獲得了10個包含有ANME-2a的細胞團基因組,包括一個僅由古菌ANME-2a構成的細胞團。這些細胞團的古菌組成都是ANME-2a,其16S rRNA基因的相似度在99.4%以上,而細菌的組成多樣性豐富:除了已經報道的Delta變形菌中的SRB以外,還有Beta變形菌中的Limnobacter、Gamma變形菌中的Acinetobacter以及未分類細菌類群OP1和Acidobacter。我們對其中6個具有代表性的細胞團進行了高通量測序和序列組裝分析,其中對一個單純由ANME-2a古菌構成的單個細胞團基因組的組裝和分析讓我們得到一個覆蓋率約為90%的ANME-2a基因組。這個ANME-2a基因組中包含有一套經典的完整七步甲烷產生途徑所需的基因,并且轉錄組分析顯示這些基因都是活躍表達的,這其中包括了先前報道在ANME-1中缺失的參與甲基和亞甲基氧化還原反應的mer基因。與甲烷產生途徑不同的是anme-2a的基因組中包含兩套編碼四氫甲烷蝶呤s-甲基轉移酶(mtr)和兩套編碼mer蛋白的基因,這是第一次在甲烷代謝古菌(包括甲烷產生菌)中發(fā)現(xiàn)同時存在兩套mtr和mer基因。這兩套基因在甲烷氧化代謝反應中都轉錄表達,但其中一套呈現(xiàn)更高的表達水平,它們是否在anme-2a的代謝反應中催化了不同的生物化學反應還有待進一步深入的研究。我們的工作支持了前人關于anme氧化甲烷可能采用逆向甲烷產生途徑的假說,還表明不同的甲烷氧化古菌(anme-1,anme-2)采用了不同的甲烷氧化代謝途徑。在研究與甲烷相關的能量產生機制方面,我們從anme-2a基因組中發(fā)現(xiàn)了多套缺少氫酶的電子傳遞和能量轉換系統(tǒng),其中包含f420h2還原酶fpo、位于細胞質和細胞膜上的輔酶b異硫酸鹽還原酶hdrab和hdrde、細胞色素c以及紅細菌固氮復合物(rnf)。擁有這類不依賴氫氣的電子傳遞和能量轉換系統(tǒng)體現(xiàn)了anme-2a對海洋環(huán)境中氫氣容易擴散的適應能力。另外多拷貝的電子傳遞蛋白hdr的發(fā)現(xiàn)暗示甲烷氧化產生的電子可以流向不同的受體物質。這種復雜而又相互關聯(lián)的電子傳遞系統(tǒng)體現(xiàn)了anme-2a細胞底物利用的多樣性和環(huán)境變化的適應性。我們還從基因組層面部分解析了與anme-2a形成共生細胞團的兩類細菌的代謝潛能。結果表明srb是自養(yǎng)型微生物,它通過還原型乙酰輔酶a途徑來固定二氧化碳;limnobacter是化能有機異養(yǎng)型微生物,可通過還原態(tài)硫的氧化獲取能量,依附在anme細胞團上可使其獲得生長所需的碳源和能源。最后我們還研究了與aom相關的微生物礦物形成機制。aom會增加周圍環(huán)境中的堿度和可溶性無機碳濃度,從而促進碳酸鹽礦物的形成。在本研究中我們觀察到所有的anme細胞團都被一層外殼狀結構包裹,考慮到微生物的外膜和膜外分泌物在碳酸鹽礦形成中的重要作用,這層外殼結構很有可能是anme參與形成碳酸鹽礦物的直接體現(xiàn)。通過納米次級離子質譜等手段的應用,我們獲得了整個富集物中的礦物組成信息以及anme細胞團表面及內部高分辨率的形態(tài)和元素分布圖,結果表明碳酸鹽的形成并沒有和細胞直接接觸,而細胞團外殼是由含硅的礦物組成。對于硅質外殼的成因我們推測是aom形成的堿性環(huán)境促進了周圍二氧化硅類礦物的溶解,由于細胞表面和周圍微環(huán)境的特性同大環(huán)境存在差異,這些溶解的硅又再次沉積在細胞團周圍形成硅質外殼。這一發(fā)現(xiàn)首次證實了anme和硅酸鹽礦物的形成有關,并表明anme在聯(lián)系海洋碳循環(huán)和硅循環(huán)中扮演著重要的角色。本文工作圍繞AOM過程的分子機制解析來展開,創(chuàng)新性地利用多學科交叉技術手段解析了厭氧甲烷氧化的生物化學反應過程和電子傳遞途徑,證實了參與AOM的共生細菌具有多樣性并部分解析了其參與C/N/S循環(huán)的代謝潛能,探討了細胞團中不同微生物之間的關系,并且闡述了AOM介導的礦物生成機制。我們的工作將為理解AOM這一海洋碳循環(huán)中關鍵的生物過程提供了新的認識。 【關鍵詞】：厭氧甲烷氧化 單細胞基因組測序 微生物成礦
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：P57;P593
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-19
• 1. 緒論19-55
• 1.1. 微生物厭氧甲烷氧化作用研究進展20-29
• 1.1.1. 厭氧甲烷氧化的研究史20
• 1.1.2. 厭氧甲烷氧化活躍的區(qū)域--冷泉和泥火山20-22
• 1.1.3. 厭氧甲烷氧化古菌的類群22-23
• 1.1.4. 其它與厭氧甲烷氧化相關的微生物23-25
• 1.1.5. 厭氧甲烷氧化古菌的形態(tài)特征25-26
• 1.1.6. 厭氧甲烷氧化機制26-29
• 1.2. 微生物產甲烷作用研究進展29-36
• 1.2.1. 生物產甲烷作用的環(huán)境生態(tài)學意義29-31
• 1.2.2. 甲烷合成代謝的酶學機制31-36
• 1.3. 硫酸鹽還原菌研究進展36-43
• 1.3.1. 硫酸鹽還原菌的分布和多樣性36-37
• 1.3.2. 異養(yǎng)型硫酸鹽還原菌37-38
• 1.3.3. 自養(yǎng)型硫酸鹽還原菌38-40
• 1.3.4. 硫酸鹽還原菌的厭氧呼吸機制40-41
• 1.3.5. 硫酸鹽還原菌與甲烷產生菌和產乙酸菌之間的競爭關系41-43
• 1.4. 微生物和礦物的相互作用43-46
• 1.4.1. 微生物和碳酸鹽的相互作用44-45
• 1.4.2. 微生物和硅酸鹽的相互作用45-46
• 1.5. 本研究所涉及到的技術方法綜述46-52
• 1.5.1. 熒光原位雜交46-47
• 1.5.2. 單細胞全基因組測序技術47-48
• 1.5.3. 高通量測序技術48-51
• 1.5.4. 納米級二次離子質譜(nanoSIMS)技術簡介51-52
• 1.6. 本文的研究意義和目標52-55
• 2. 材料和方法55-71
• 2.1. 富集物樣品描述55
• 2.2. 富集培養(yǎng)基的制備55-57
• 2.3. 探針和引物57-58
• 2.4. 主要儀器58-59
• 2.5. 主要試劑59
• 2.6. 試劑盒59-60
• 2.7. 感受態(tài)細胞和質粒60
• 2.8. 工具軟件60
• 2.9. 微生物細胞的蛋白質染色60-61
• 2.10. 微生物細胞的多糖染色61
• 2.11. 微生物細胞的熒光原位雜交(FISH)61-63
• 2.11.1. 樣品的固定61
• 2.11.2. 樣品的雜交和多余探針的洗脫61-62
• 2.11.3. 樣品的顯微鏡觀察62-63
• 2.12. Percoll不連續(xù)密度梯度離心去除富集物樣品中的雜質63
• 2.13. 顯微操作法分選單細胞團63-64
• 2.14. 全基因組MDA擴增、驗證和純化64-65
• 2.15. 細胞團微生物組成分析65-66
• 2.16. 系統(tǒng)進化樹構建66
• 2.17. 單細胞團基因組測序、組裝和注釋66
• 2.18. ANME-2a全基因組覆蓋率的計算66-68
• 2.19. 應用于nanoSIMS和SEM的樣品制備方法68-69
• 2.20. 富集物樣品的礦物組成分析69-71
• 3. 結果和討論71-146
• 3.1. 單個細胞團微生物組成分析71-79
• 3.1.1. 基于16s rRNA基因分析的單個細胞團的微生物組成71-77
• 3.1.2. 不同微生物組成的單個細胞團在顯微鏡下的形態(tài)77-79
• 3.2. 單細胞團基因組測序結果總覽79-81
• 3.3. ANME-2a的基因組分析81-103
• 3.3.1. 厭氧甲烷氧化途徑81-87
• 3.3.2. 與AOM相關的電子傳遞系統(tǒng)87-94
• 3.3.3. 潛在的氫酶94-102
• 3.3.4. 本章小結102-103
• 3.4. 與ANME-2a共生的SRB的功能基因分析103-109
• 3.4.1. SRB的碳源利用方式103-107
• 3.4.2. SRB的硫酸鹽呼吸107-108
• 3.4.3. 本章小結和討論108-109
• 3.5. 與ANME-2a共生的一株Beta變形菌Limnobacter spp.的基因組功能分析109-128
• 3.5.1. 研究背景109
• 3.5.2. M12基因組特征109-110
• 3.5.3. Limnobacter sp.M12的碳源獲取方式110-118
• 3.5.4. Limnobacter sp.M12的氮源獲取方式118-119
• 3.5.5. Limnobacter sp.M12的硫氧化途徑119-121
• 3.5.6. Limnobacter sp.M12的厭氧呼吸121
• 3.5.7. Limnobacter sp.M12的其它環(huán)境適應機制121-126
• 3.5.8. 本章小結126-128
• 3.6. ANME、SRB以及Limnobacter三者之間的聯(lián)系128-130
• 3.7. ANME-2a細胞外殼結構的組成、結構以及功能分析130-146
• 3.7.1. 細胞團外殼結構在顯微鏡下的形態(tài)130-131
• 3.7.2. 外殼結構有機質成分的研究131-132
• 3.7.3. 外殼結構的超微觀形態(tài)結構和組成元素分析132-133
• 3.7.4. 外殼結構的立體結構元素組成分析133-135
• 3.7.5. 細胞團元素比值分析135-136
• 3.7.6. 富集物樣品主要礦物組成分析136-141
• 3.7.7. AOM細胞團成礦機制141-143
• 3.7.8. ANME-2a外殼的生物學意義143-145
• 3.7.9. ANME-2a外殼的地質學意義145
• 3.7.10. 本草小結145-146
• 4. 全文結論146-148
• 5. 參考文獻148-168
• 6. 致謝168-169
• 7. 學術論文和科研成果目錄169

您可以在本站搜索以下學術論文文獻來了解更多相關內容